免疫组化与原位杂交课件

1、免疫组化与原位杂交1 免疫组织化学免疫组织化学和和原位杂交原位杂交 immunohistochemistry & in situ hybridization免疫组化与原位杂交2 免疫组织化学免疫组织化学 前提条件：所使用的抗体必须能用于免疫组化。前提条件：所使用的抗体必须能用于免疫组化。 一、基本原理一、基本原理 ： 利用利用 抗体（抗体（antibody）与）与 相应抗原（相应抗原（antigen）的特）的特 异性结合异性结合, 通过与抗体连接通过与抗体连接 的酶反应或荧光染料显示的酶反应或荧光染料显示 抗原所在的位置。抗原所在的位置。免疫组化与原位杂交3二、常用于标记抗体的标记物二

2、、常用于标记抗体的标记物一）酶（一）酶（enzymeenzyme）1.1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, hrphorseradish peroxidase, hrp） 辣根过氧化物辣根过氧化物酶的作用物（底物，酶的作用物（底物，substratesubstrate） 1 1）二氨基联苯胺（二氨基联苯胺（3,33,3-diaminobenzidine-diaminobenzidine，dabdab） 显色特点：显色特点： - 棕色棕色 -不溶于水及脂类溶剂（酒精不溶于水及脂类溶剂（酒精 ethanol, 二甲苯二甲苯xylene） -不扩散不扩散

3、-永久保存永久保存 2 2）3 3氨基氨基9 9乙基卡巴唑（乙基卡巴唑（3-amino-9-ethylcarbazole3-amino-9-ethylcarbazole，aecaec）免疫组化与原位杂交4 显色特点：显色特点： -棕红色棕红色 -不溶于水，但不溶于水，但溶于溶于脂类溶剂脂类溶剂 -容易扩散容易扩散 -不能永久保存不能永久保存 3 3）4 4氯氯1 1萘酚（萘酚（4-chloro-1-naphthol4-chloro-1-naphthol，cncn） 显色特点：显色特点： -蓝色蓝色 -不溶于水，但溶于脂类溶剂不溶于水，但溶于脂类溶剂 -容易扩散容易扩散 -不能永久保存不能永久保

4、存 4 4）四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine,tmb3,3,5,5-tetramethylbenzidine,tmb） 显色特点：显色特点： -深蓝色深蓝色免疫组化与原位杂交5 - -不溶于水及脂类溶剂不溶于水及脂类溶剂 -不扩散不扩散 -永久保存永久保存2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, apalkaline phosphatase, ap） 碱性磷酸酶的碱性磷酸酶的作用物（底物，作用物（底物，substratesubstrate） 1 1）四唑淡蓝四唑淡蓝 /5-/5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚

5、吲哚- -磷酸盐磷酸盐(nitro-blue-(nitro-blue- tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlyl- tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlyl- phosphate phosphate, nbt/bcipnbt/bcip） 显色特点：显色特点： -紫色紫色 -不溶于水但溶于脂类溶剂不溶于水但溶于脂类溶剂 -容易扩散容易扩散 -不能永久保存不能永久保存 免疫组化与原位杂交62 2）快红快红（固红（固红/ /萘酚磷酸盐，萘酚磷酸盐，fast red tr/naphthol as-mxfast red tr/nap

6、hthol as-mx） 显色特点：显色特点： -桃红色桃红色 -不溶于水但溶于脂类溶剂不溶于水但溶于脂类溶剂 -容易扩散容易扩散 -不能永久保存不能永久保存 3 3）快蓝快蓝（固蓝（固蓝bb/bb/萘酚磷酸盐，萘酚磷酸盐，fast blue bb/naphthol as-mx)fast blue bb/naphthol as-mx) 显色特点：显色特点： -蓝色蓝色 -不溶于水但溶于脂类溶剂不溶于水但溶于脂类溶剂 -容易扩散容易扩散 -不能永久保存不能永久保存4 4）品红（品红）品红（品红/ /萘酚磷酸盐，萘酚磷酸盐，fuchsin/naphthol as-trfuchsin/naphtho

7、l as-tr）免疫组化与原位杂交7 显色特点：显色特点： -红色红色 -不溶于水及脂类溶剂不溶于水及脂类溶剂 -不扩散不扩散 -永久保存永久保存dabfast bluefast rednbt/bcipaec免疫组化与原位杂交8二）荧光染料（二）荧光染料（fluorescent dyefluorescent dye）免疫组化与原位杂交9免疫组化与原位杂交10免疫组化与原位杂交11 常用的荧光染料常用的荧光染料1.1.异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanatefluorescein isothiocyanate，fitcfitc）分子量为分子量为3893

8、89，最大吸收光波长为，最大吸收光波长为490490495nm495nm，最大发射光波长，最大发射光波长为为520520530nm530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧，呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧光素。光素。2.2.四甲基异四甲基异硫氰酸罗达明硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, tmritctetramethylrhodamine isothiocyanate, tmritc） 分子量为分子量为444444，最大吸收光波长为，最大吸收光波长为550nm550nm，最大发射光波长为，最大发射光波长为620nm62

9、0nm，呈现橙红色荧光。呈现橙红色荧光。免疫组化与原位杂交123.3.羰花青类（羰花青类（carbocyanine dyes)carbocyanine dyes)荧光较强，不易淬灭，近年来应用广泛。荧光较强，不易淬灭，近年来应用广泛。4.alexa fluor4.alexa fluor免疫组化与原位杂交13吸收光波及发射光波长范围广，也是目前应用最广泛的荧光素。吸收光波及发射光波长范围广，也是目前应用最广泛的荧光素。免疫组化与原位杂交14三）生物素三）生物素( (维生素维生素h, biotin )h, biotin ) 水溶性维生素，属于维生素水溶性维生素，属于维生素b b族。相对分子量族。相

10、对分子量244244， 分子结构简单，通过其羧基与被标记物的氨基结分子结构简单，通过其羧基与被标记物的氨基结 合，可标记抗体、酶、激素、核酸、凝集素等，合，可标记抗体、酶、激素、核酸、凝集素等， 由于其分子小，不影响被标记物的理化和免疫学由于其分子小，不影响被标记物的理化和免疫学 特性。极易于亲和素（特性。极易于亲和素（avidinavidin）结合，形成）结合，形成亲和亲和 素素- -生物素复合物（生物素复合物（avidin-biotin complex,abcavidin-biotin complex,abc）因此，常与亲）因此，常与亲 和素一起被用于免疫组化的和素一起被用于免疫组化的ab

11、cabc方法中。方法中。四）胶体金（四）胶体金（colloidal goldcolloidal gold） 又称金溶胶（又称金溶胶（gold solutiongold solution），是指分），是指分 散相粒子直径在散相粒子直径在l150nml150nm之间的金溶胶，之间的金溶胶， 能稳定又迅速地吸附蛋白质，能稳定又迅速地吸附蛋白质，可以作为可以作为 标记物标记抗体、抗原、激素、核酸等，标记物标记抗体、抗原、激素、核酸等， 在药物检测、生物医学等许多领域有广在药物检测、生物医学等许多领域有广 泛的应用，常用于透射电镜泛的应用，常用于透射电镜。 免疫组化与原位杂交15三、组织标本的制备三、组

12、织标本的制备一）一）组织标本的取材组织标本的取材 取材原则取材原则: :尽可能快的切取所需组织浸入固定液或快速冰冻尽可能快的切取所需组织浸入固定液或快速冰冻, ,保持保持 组织的新鲜以组织的新鲜以最大限度地防止抗原破坏和降解。最大限度地防止抗原破坏和降解。二）二）固定固定（fixation):fixation):根据所检测抗原的性质选择适当的固定液根据所检测抗原的性质选择适当的固定液 和固定方法，固定液用量应是标本的和固定方法，固定液用量应是标本的4040倍。倍。1.1.常用的固定剂常用的固定剂(fixative solution)(fixative solution)1 1）单纯固定剂）单纯

13、固定剂 丙酮丙酮(acetone)(acetone)：主要用于新鲜组织冰冻切片的快速固定，以：主要用于新鲜组织冰冻切片的快速固定，以 检测细胞表面抗原、自身抗体及细胞内外的免疫球蛋白。检测细胞表面抗原、自身抗体及细胞内外的免疫球蛋白。甲醇甲醇(methanol)(methanol)：与：与丙酮相似。丙酮相似。 免疫组化与原位杂交16乙醇乙醇(ethanol):(ethanol):与丙酮相似。与丙酮相似。甲醛甲醛(formaldehyde):(formaldehyde):使用最广泛的固定剂，有多种剂型，包使用最广泛的固定剂，有多种剂型，包 括：括： 福马林（福马林（formolformol）:

14、:即即10%10%甲醛水溶液，最常用的固定剂，甲醛水溶液，最常用的固定剂， 适用于各种组织固定。适用于各种组织固定。 中性福马林：含过饱和碳酸钙中性福马林：含过饱和碳酸钙（calcium carbonate)calcium carbonate)的的10%10%甲甲 醛水溶液。醛水溶液。 缓冲中性福马林：以磷酸盐缓冲液配制的缓冲中性福马林：以磷酸盐缓冲液配制的10%10%甲醛溶液。甲醛溶液。 4%4%多聚甲醛（多聚甲醛（paraformaldehydeparaformaldehyde）：以磷酸盐缓冲液配制的）：以磷酸盐缓冲液配制的 4%4%多聚甲醛溶液。多聚甲醛溶液。2 2）复合固定剂）复合固定

15、剂 免疫组化与原位杂交17 bouin bouin氏液：含苦味酸（氏液：含苦味酸（nitroxanthic acidnitroxanthic acid）和冰醋酸）和冰醋酸 （glacial acetic acidglacial acetic acid）的甲醛溶液。）的甲醛溶液。 zambonizamboni氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。 plpplp（periodate-lysine-paraformaldehydeperiodate-lysine-paraformaldehyde）：含过碘酸和赖）：含过碘酸和赖 氨酸的多聚甲醛溶液，多用于需预固定的冰

16、冻组织切片。氨酸的多聚甲醛溶液，多用于需预固定的冰冻组织切片。 2.2.固定方法：固定方法：必须用预冷（必须用预冷（4 4）的固定液固定，并保持低温持）的固定液固定，并保持低温持 续固定至所需时间续固定至所需时间。 1 1）灌注固定（）灌注固定（perfusion fixationperfusion fixation）：最好的固定方法，尤其适）：最好的固定方法，尤其适 用于神经组织如脑、脊髓和视网膜。用于神经组织如脑、脊髓和视网膜。灌注固定后应迅速切取灌注固定后应迅速切取 所需组织，在预冷的固定液中继续浸泡固定至所需时间。所需组织，在预冷的固定液中继续浸泡固定至所需时间。2 2）浸泡固定：最普

17、通和常用的固定方法，适用于除神经组织外的浸泡固定：最普通和常用的固定方法，适用于除神经组织外的 各种组织。各种组织。免疫组化与原位杂交18三）包埋和切片（三）包埋和切片（embedding and sectionembedding and section）1.1.石蜡切片基本步骤：石蜡切片基本步骤：1 1）逐级乙醇溶液脱水：使组织脱水，便于二甲苯（）逐级乙醇溶液脱水：使组织脱水，便于二甲苯（xylenexylene）介入）介入 的过程。时间的长短取决于组织块的过程。时间的长短取决于组织块的大小及的大小及结构。置结构。置80%80%以上的以上的 乙醇溶液时间过长，会使组织变硬变脆，应当避免。乙醇

18、溶液时间过长，会使组织变硬变脆，应当避免。 70% 80% 90% 100%i 100%ii 100%iii70% 80% 90% 100%i 100%ii 100%iii 2 2）透明：）透明：组织组织用二甲苯处理用二甲苯处理以便石蜡以便石蜡介入的过程，时间长短取决介入的过程，时间长短取决 于组织快的大小，但不宜过长，以免组织过硬易脆。于组织快的大小，但不宜过长，以免组织过硬易脆。 二甲苯二甲苯i i 二甲苯二甲苯ii ii 二甲苯二甲苯iii iii 3 3）浸蜡：组织经二甲苯（）浸蜡：组织经二甲苯（xylenexylene）处理后石蜡介入的过程，时间）处理后石蜡介入的过程，时间 长短取决

19、于组织快的大小。温度应控制在长短取决于组织快的大小。温度应控制在56 - 6056 - 60。4 4）包埋：用模具使组织块包于石蜡中成型的过程。）包埋：用模具使组织块包于石蜡中成型的过程。免疫组化与原位杂交195 5）修快：将包有组织的蜡块用刀切去多余的部分，修成一定形状）修快：将包有组织的蜡块用刀切去多余的部分，修成一定形状 的过程。的过程。6 6）切片：）切片：将包有组织的蜡块安装在切片机上进行切割的过程。将包有组织的蜡块安装在切片机上进行切割的过程。一一 般切般切3 36 6m m。2.2.冰冻切片的基本步骤：冰冻切片的基本步骤：1 1）固定：根据所检测组织的抗原性质决定是否先进行固定及

20、选择固定：根据所检测组织的抗原性质决定是否先进行固定及选择 适当的固定剂。除非有特殊要求，否则应当适当的固定剂。除非有特殊要求，否则应当先进行固定以防止先进行固定以防止 抗原破坏及降解。抗原破坏及降解。 常用的固定液是常用的固定液是4%4%多聚甲醛（多聚甲醛（paraformaldehydeparaformaldehyde）2 2）减少组织水分防止冰晶形成）减少组织水分防止冰晶形成: :通常采用高渗的通常采用高渗的30%30%蔗糖蔗糖(sucrose)(sucrose) 溶液吸收组织中的水分。溶液吸收组织中的水分。3 3）包埋：用于）包埋：用于冰冻切片组织的包埋剂冰冻切片组织的包埋剂是是oct

21、 ( cryo embedding oct ( cryo embedding medium ) medium ) 免疫组化与原位杂交204 4）切片：将包在）切片：将包在octoct中的组织安装在冰冻切片机上进行切割，切中的组织安装在冰冻切片机上进行切割，切 片的厚度一般为片的厚度一般为5-205-20m。5 5）后固定：适用于未经固定的冰冻组织切片，常用固定液是丙酮）后固定：适用于未经固定的冰冻组织切片，常用固定液是丙酮 （acetone)acetone)和和4%4%多聚甲醛。多聚甲醛。四）预防脱片的措施：四）预防脱片的措施： 载玻片的处理：载玻片的处理： 重铬酸钾（重铬酸钾（bichrom

22、icum kaliumbichromicum kalium）浓硫酸（）浓硫酸（concentrated concentrated sulfuric acidsulfuric acid）清洁液浸泡）清洁液浸泡2424小时小时 充分流水冲洗充分流水冲洗 去去离子水冲洗离子水冲洗2 2遍遍 烘干烘干2.2.粘附剂的使用：粘附剂的使用： 2%32%3氨基乙氧基甲硅烷（氨基乙氧基甲硅烷（3-amino propyltriethoxy silane,3-amino propyltriethoxy silane, apes apes）：适用于石蜡切片的载玻片。）：适用于石蜡切片的载玻片。 0.1%0.1%多

23、聚左旋赖氨酸（多聚左旋赖氨酸（poly-l-lysinepoly-l-lysine）：）：适用于冰冻切片的适用于冰冻切片的 载玻片载玻片 免疫组化与原位杂交21四、常用的免疫组化方法四、常用的免疫组化方法一）免疫荧光法（一）免疫荧光法（应注意标本中自应注意标本中自 发荧光的影响发荧光的影响）1.1.直接法或一步法直接法或一步法(direct method (direct method or one-step staining method) or one-step staining method) 用标记了荧光素的特异性抗体直用标记了荧光素的特异性抗体直 接与标本中相应的抗原结合。接与标本中相

24、应的抗原结合。 优点：特异性高优点：特异性高 缺点：敏感性低缺点：敏感性低 2.2.间接法（间接法（indirect methodindirect method）：）： 荧光素不是荧光素不是标记在与标本中相应标记在与标本中相应 抗原结合的特异性抗体上抗原结合的特异性抗体上，而是而是 标记在抗特异性抗体的第二抗体标记在抗特异性抗体的第二抗体 上。上。 优点：敏感性高优点：敏感性高 缺点：特异性低缺点：特异性低 免疫组化与原位杂交22二）免疫酶法二）免疫酶法1.1.直接法或一步法直接法或一步法(direct method or one-step staining method) (direct m

25、ethod or one-step staining method) 用标记了酶的特异性抗体直接与标本中相应的抗原结合，以酶底用标记了酶的特异性抗体直接与标本中相应的抗原结合，以酶底 物的反应显示抗原的分布物的反应显示抗原的分布。2.2.间接法间接法(indirect method)(indirect method)： 常用的间接法：常用的间接法：1 1）两步法两步法（two-step staining methodtwo-step staining method）：）：优点优点: :敏感性很高，特异性高，不受内源性生物素影响。敏感性很高，特异性高，不受内源性生物素影响。缺点缺点: :背景染色

26、高。背景染色高。免疫组化与原位杂交232)2)过氧化物酶抗过氧化物酶过氧化物酶抗过氧化物酶（peroxidase anti-peroxidaseperoxidase anti-peroxidase，pappap） 或碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（或碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（alkaline phosphatase anti- alkaline phosphatase anti- alkaline phosphatase, alkaline phosphatase, apaapapaap）methodmethod优点：特异性高，优点：特异性高， 背景染色很低，不受内源性生物素影响。背景染色很低，不受

27、内源性生物素影响。缺点：敏感性相对低。缺点：敏感性相对低。免疫组化与原位杂交243.3.亲和素亲和素- -生物素生物素- -过氧化物酶复合物过氧化物酶复合物( avidin-biotin-eroxidase( avidin-biotin-eroxidase complex complex，abc )abc )或链亲和素或链亲和素- -生物素生物素- -过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法 (labelled strepavidin-biotin-eroxidase complex(labelled strepavidin-biotin-eroxidase complex，lsab)lsab)

28、method method 是是最广泛使用但不建议使用的方法，最广泛使用但不建议使用的方法，因为目前尚无去除内源性因为目前尚无去除内源性 生物素和亲和素的方法。生物素和亲和素的方法。 优点：敏感性高，特异性很低。优点：敏感性高，特异性很低。 缺点：极易受内源性生物素影响，假阳性率极高。缺点：极易受内源性生物素影响，假阳性率极高。免疫组化与原位杂交25五、免疫组织化学的特异性与敏感性五、免疫组织化学的特异性与敏感性一）特异性（一）特异性（specificity):specificity):指免疫组化染色结果是否真正由特异指免疫组化染色结果是否真正由特异 性抗体和相应抗原结合而产生。包括方法特异性

29、和抗体特异性。性抗体和相应抗原结合而产生。包括方法特异性和抗体特异性。1.1.方法特异性：证明是由抗体结合引起的结果。方法特异性：证明是由抗体结合引起的结果。 如：如： 加一抗加一抗 - - 有染色结果有染色结果 不加一抗不加一抗 - - 无染色结果无染色结果2.2.抗体特异性：证明是由所检抗原而非其它成分与一抗结合引起抗体特异性：证明是由所检抗原而非其它成分与一抗结合引起 的染色结果。的染色结果。 如：用肝细胞抗体染肝组织如：用肝细胞抗体染肝组织 - - 有染色结果有染色结果 用肝细胞抗体染肾组织用肝细胞抗体染肾组织 - - 无染色结果无染色结果二）特异性染色和非特异性染色二）特异性染色和非

30、特异性染色 1.1.特异性染色：由一抗与相应抗原特异性结合而产生的染色。染特异性染色：由一抗与相应抗原特异性结合而产生的染色。染 免疫组化与原位杂交26 色部位是抗原分布的部位，显示出一定的结构背景，如细胞核色部位是抗原分布的部位，显示出一定的结构背景，如细胞核 细胞质和细胞膜，或组织和细胞内的某些特殊成分。细胞质和细胞膜，或组织和细胞内的某些特殊成分。2.2.非特异性：不是非特异性：不是由一抗与相应抗原特异性结合而引起的染色。由一抗与相应抗原特异性结合而引起的染色。染染 色部位与抗原分布的部位无关。色部位与抗原分布的部位无关。3.3.特异性染色的检测特异性染色的检测1 1）设阳性对照：用已知

31、抗原存在的标本对比所检测的标本。）设阳性对照：用已知抗原存在的标本对比所检测的标本。2 2）设阴性对照：用已知抗原不存在的标本或除去一抗的方法对比）设阴性对照：用已知抗原不存在的标本或除去一抗的方法对比 所检测的标本。所检测的标本。 阴性标本阴性标本: :不存在被检抗原的标本。不存在被检抗原的标本。 空白实验：组化染色程序中不加一抗。空白实验：组化染色程序中不加一抗。 替代实验：替代实验：组化染色程序中组化染色程序中用同型（用同型（isotypeisotype）抗体替代一抗。）抗体替代一抗。免疫组化与原位杂交27 吸收实验：组化染色程序中用过量相应抗原吸收一抗以阻止标吸收实验：组化染色程序中用

32、过量相应抗原吸收一抗以阻止标 本中的抗原与一抗结合。本中的抗原与一抗结合。三）敏感性三）敏感性(sensitivity)(sensitivity)：指所用的免疫组化方法能检测的抗原：指所用的免疫组化方法能检测的抗原 量。量。1.1.敏感性与特异性的关系：一般是相反的关系。敏感性与特异性的关系：一般是相反的关系。2.2.提高敏感性的方法：提高敏感性的方法：选用敏感的免疫组化染色方法：选用敏感的免疫组化染色方法： 如如envisionenvision两步法，两步法，pappap或或apaapapaap法，法，abcabc法。法。选用含有放大作用的酶的免疫组化染色方法：选用含有放大作用的酶的免疫组化

33、染色方法： 如碱性磷酸酶（如碱性磷酸酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase）对底物（）对底物（substratesubstrate） 的作用随时间的增加而增加，可选用含的作用随时间的增加而增加，可选用含碱性磷酸酶的碱性磷酸酶的envisionenvision两两 步法或步法或apaapapaap法。法。免疫组化与原位杂交28增加抗体的孵育时间：一般采取增加抗体的孵育时间：一般采取4 4过夜的方式。过夜的方式。四）非特异性染色的来源及消除四）非特异性染色的来源及消除1.1.标本固定不适当或不充分标本固定不适当或不充分 丙酮固定的标本，尤其是它的冰冻切

34、片标本，有极强的非特异性丙酮固定的标本，尤其是它的冰冻切片标本，有极强的非特异性 染色。应选用适当的固定剂及充分固定。染色。应选用适当的固定剂及充分固定。2.2.染色过程中切片干燥染色过程中切片干燥 应用湿盒及防止切片干燥应用湿盒及防止切片干燥3.3.内远性酶活性未被抑制或消耗内远性酶活性未被抑制或消耗 经固定的标本，其细胞内的过氧化物酶经固定的标本，其细胞内的过氧化物酶(peroxidase)(peroxidase)和碱性磷酸和碱性磷酸 酶（酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase）不会被灭活，仍保持活性。）不会被灭活，仍保持活性。 过氧化物酶过氧

35、化物酶 - 0.3%h2o2- 0.3%h2o2消耗消耗 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 - - 左旋咪唑抑制，微波加热或左旋咪唑抑制，微波加热或0.2n 0.2n 盐酸盐酸(hcl)(hcl)破破 坏。坏。 采用免疫荧光方法。采用免疫荧光方法。免疫组化与原位杂交294.4.游离醛基游离醛基 醛类固定剂未洗净，残留的游离醛基易与抗体非特异性结合。醛类固定剂未洗净，残留的游离醛基易与抗体非特异性结合。 彻底冲洗及用赖氨酸彻底冲洗及用赖氨酸、甘氨酸、白蛋白或正常血清封闭。、甘氨酸、白蛋白或正常血清封闭。5.fc5.fc受体受体 标本中，尤其是冰冻切片或细胞甩片中，细胞膜上的免疫球蛋白标本中，尤其是冰冻切片或

36、细胞甩片中，细胞膜上的免疫球蛋白 (immunoglobulin) fc(immunoglobulin) fc受体与抗体结合。受体与抗体结合。 与二抗同源的血清或非特异性抗体封闭。与二抗同源的血清或非特异性抗体封闭。6.6.疏水键和离子键疏水键和离子键 免疫球蛋白可通过疏水键和离子键与标本中的蛋白及其他成分非免疫球蛋白可通过疏水键和离子键与标本中的蛋白及其他成分非 特异性结合，抗血清中的补体也可通过疏水键和离子键与标本中特异性结合，抗血清中的补体也可通过疏水键和离子键与标本中 的蛋白结合，再与抗体结合。的蛋白结合，再与抗体结合。 正常血清封闭正常血清封闭 尽可能稀释抗体尽可能稀释抗体 灭活补体

37、灭活补体 增加抗体稀释液的离子强度（将增加抗体稀释液的离子强度（将pbspbs改为改为tbstbs） 抗体稀释液中添加去污剂（如抗体稀释液中添加去污剂（如tritonx-100, twen-20)tritonx-100, twen-20)免疫组化与原位杂交307.7.天然抗体天然抗体 接受免疫的动物在自然过程中产生的对某些动物组织或血清成分接受免疫的动物在自然过程中产生的对某些动物组织或血清成分 的抗体。的抗体。 用相对应的动物血清或组织成分吸收用相对应的动物血清或组织成分吸收, 或尽可能提高抗体稀释度。或尽可能提高抗体稀释度。8.8.杂质抗体杂质抗体 由于免疫原不纯，混有某些组织成分免疫动物

38、所产生的抗体。由于免疫原不纯，混有某些组织成分免疫动物所产生的抗体。 尽可能提高抗体稀释度。尽可能提高抗体稀释度。9.9.自发荧光自发荧光 标本中的某些成分如红细胞标本中的某些成分如红细胞、弹性纤维、脂质等有自发荧光。、弹性纤维、脂质等有自发荧光。 改用免疫显色方法。改用免疫显色方法。六、免疫组化双重及多重染色六、免疫组化双重及多重染色一）免疫荧光一）免疫荧光双重及多重染色双重及多重染色 免疫组化与原位杂交311.1.免疫荧光双重染色免疫荧光双重染色1)1)直接法：直接法： 直接用不同荧光染料标记的两种抗体孵育标本。直接用不同荧光染料标记的两种抗体孵育标本。 如用如用fitc-cd45anti

39、bodyfitc-cd45antibody（绿色）（绿色）和和 alexa flour555-cd20alexa flour555-cd20 antibodyantibody（红色）（红色）检测淋巴组织中的检测淋巴组织中的t t细胞和细胞和b b细胞。细胞。 优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主（优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主（hosthost）的）的 抗体。抗体。 缺点：敏感性低。缺点：敏感性低。2)2)间接法间接法: : 第一抗体来源于第一抗体来源于非非同一种属同一种属, 可用以下方法：可用以下方法： a)a)先用各自非标记一抗孵育标本，再用不同荧光染料标记的各自二先

40、用各自非标记一抗孵育标本，再用不同荧光染料标记的各自二 抗结合一抗。二抗可以是抗结合一抗。二抗可以是来源于同一种属，也可以不是来源于同一种属，也可以不是。免疫组化与原位杂交32如：如：一抗一抗: mouse anti-cd45 rabbit anti-cd20: mouse anti-cd45 rabbit anti-cd20二抗二抗: : fitc-goat anti-mousefitc-goat anti-mouse iggigg tritc-goat anti-rabbit iggtritc-goat anti-rabbit igg (green)(green) or or tritc-

41、donkey anti-rabbit iggtritc-donkey anti-rabbit igg (red)(red) 优点：增加了敏感性。优点：增加了敏感性。 缺点：需用缺点：需用3-43-4种抗体，且一抗不能来源于同一种属。由于所用种抗体，且一抗不能来源于同一种属。由于所用 的抗体来源于不同种属，存在交叉反应的可能性，使用前的抗体来源于不同种属，存在交叉反应的可能性，使用前 需进行种属间的交叉实验。需进行种属间的交叉实验。b)b)也可先完成第一套抗体显示第一抗原，再进行第二套抗体显示第也可先完成第一套抗体显示第一抗原，再进行第二套抗体显示第 二抗原。二抗原。第一抗体来源于第一抗体来源于

42、同一种属，同一种属，可采取以下方法进行：可采取以下方法进行：a)a)在在完成第一套抗体显示第一抗原及保存了相应的图像后，用微波完成第一套抗体显示第一抗原及保存了相应的图像后，用微波 处理灭活第一套抗体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二处理灭活第一套抗体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二 抗可以是来源于同一种属，也可以不是抗可以是来源于同一种属，也可以不是, 但须标记不同荧光染料但须标记不同荧光染料。免疫组化与原位杂交33b)b)在完成第一套抗体显示第一抗原后，用饱和的与第一套一抗同一在完成第一套抗体显示第一抗原后，用饱和的与第一套一抗同一 种属的免疫球蛋白封闭第一套抗体中二抗的未结合位

43、点，再用荧种属的免疫球蛋白封闭第一套抗体中二抗的未结合位点，再用荧 光标记的第二套一抗直接进行第二抗原的显示。光标记的第二套一抗直接进行第二抗原的显示。2.2.免疫荧光多重染色免疫荧光多重染色 理论上可以使用理论上可以使用n n个不同荧光染料标记的抗体检测个不同荧光染料标记的抗体检测n n个不同抗原，个不同抗原， 实际使用上受荧光显微镜设置的荧光通道限制。通常荧光显微镜实际使用上受荧光显微镜设置的荧光通道限制。通常荧光显微镜 最多只能设置最多只能设置3-43-4个荧光通道。个荧光通道。1)1)直接法：直接法： 可直接用可直接用3 3个或个或3 3个以上不同荧光染料标记的一抗显示相应的抗原。个以

44、上不同荧光染料标记的一抗显示相应的抗原。2)2)间接法间接法: : 优点：可在一标本上检测优点：可在一标本上检测3 3个或个或3 3个以上不同的抗原。个以上不同的抗原。 缺点：由于缺点：由于不同种属来源的抗体间存在交叉反应的可能性大，不同种属来源的抗体间存在交叉反应的可能性大，非非 特异性反应极高。特异性反应极高。 免疫组化与原位杂交34第一抗体来源于第一抗体来源于非非同一种属，同一种属，可用以下方法：可用以下方法：a)a)先用先用3 3种或种或3 3种以上不同种属的非标记一抗孵育标本，再用不同荧种以上不同种属的非标记一抗孵育标本，再用不同荧 光染料标记的二抗各自结合一抗，一抗和二抗间不能有来

45、源于同光染料标记的二抗各自结合一抗，一抗和二抗间不能有来源于同 一种属的抗体。一种属的抗体。b)b)也可按先后顺序进行各套抗体显示各自抗原。也可按先后顺序进行各套抗体显示各自抗原。第一抗体来源于第一抗体来源于同一种属：同一种属： 可在完成每套抗体显示各自抗原及保存了相应的图像后，用微波可在完成每套抗体显示各自抗原及保存了相应的图像后，用微波 处理灭活各套抗体处理灭活各套抗体, ,再进行后续不同荧光的各套抗体显示后续的再进行后续不同荧光的各套抗体显示后续的 各个抗原。各个抗原。 此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。二）免疫酶双重及多重染

46、色二）免疫酶双重及多重染色 前提条件：必须预先去除内源性因数（如过氧化物酶，碱性磷酸前提条件：必须预先去除内源性因数（如过氧化物酶，碱性磷酸 酶，生物素，亲和素等）的影响。酶，生物素，亲和素等）的影响。应该提醒的是，目前尚无方法应该提醒的是，目前尚无方法 去除内源性生物素和亲和素。去除内源性生物素和亲和素。免疫组化与原位杂交351.1.免疫酶双重染色免疫酶双重染色1)1)直接法：直接法： 先去除先去除内源性内源性因数因数( (如过氧化物酶，碱性磷酸酶，生物素，亲和如过氧化物酶，碱性磷酸酶，生物素，亲和 素等素等) )的活性的活性, 再加不同的酶标记的抗体再加不同的酶标记的抗体, ,以各自抗体标

47、记酶的底以各自抗体标记酶的底 物反应显示抗原的分布。如用物反应显示抗原的分布。如用hrphrp-cd68 antibody -cd68 antibody 和和 apap-cd105-cd105 antibody antibody 检测炎症组织中的巨噬细胞和中性粒细胞检测炎症组织中的巨噬细胞和中性粒细胞, ,分别以分别以dabdab ( (棕色棕色) )和和 fast redfast red（红色红色）显色。）显色。 优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主的抗体。优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主的抗体。 缺点：敏感性低缺点：敏感性低, ,必须用不同的标记酶及底物。必须用不同的标

48、记酶及底物。2)2)间接法间接法: : 优点：敏感性高。优点：敏感性高。 缺点：特异性低。缺点：特异性低。第一抗体来源于第一抗体来源于非非同一种属，同一种属，可用以下方法：可用以下方法：a)a)先用各自非标记一抗孵育标本，再加不同酶标记的二抗系统先用各自非标记一抗孵育标本，再加不同酶标记的二抗系统( (如如 hrp-polymerhrp-polymer和和ap-polymer,sp-abcap-polymer,sp-abc和和sap-abc)sap-abc)及酶底物显示各自及酶底物显示各自 免疫组化与原位杂交36 抗原。二抗系统可以是来源于同一种属，也可以不是，但必须标抗原。二抗系统可以是来源

49、于同一种属，也可以不是，但必须标 记不同的酶。记不同的酶。b)b)也可先完成第一套抗体系统显示第一抗原，再进行第二套抗体系也可先完成第一套抗体系统显示第一抗原，再进行第二套抗体系 统显示第二抗原。它们的二抗系统可以是来源于同一种属，也可统显示第二抗原。它们的二抗系统可以是来源于同一种属，也可 以不是，但必须标记不同的酶。以不是，但必须标记不同的酶。c)c)如欲使用如欲使用pappap和和apaapapaap的二抗系统，则二抗系统之间及二抗系统与的二抗系统，则二抗系统之间及二抗系统与 一抗之间一抗之间不能不能有来源于有来源于同一种属同一种属的抗体。的抗体。第一抗体来源于第一抗体来源于同一种属：同

50、一种属： 可在完成第一套抗体显示第一抗原后可在完成第一套抗体显示第一抗原后, , 用微波处理灭活第一套抗用微波处理灭活第一套抗 体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二抗可以是来源于同体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二抗可以是来源于同 一种属，也可以不是一种属，也可以不是, ,但必须标记不同的酶。但必须标记不同的酶。2.2.免疫酶多重染色免疫酶多重染色 理论上可以使用理论上可以使用n n个不同酶标记的抗体显示个不同酶标记的抗体显示n n个不同抗原，实际使个不同抗原，实际使 用上受常用标记酶的限制。通常最常用的是用上受常用标记酶的限制。通常最常用的是过氧化物酶过氧化物酶和和碱性磷碱性磷免疫

51、组化与原位杂交37 酸酶酸酶，而酶的底物则相对多些。，而酶的底物则相对多些。1)1)直接法直接法: : 受常用标记酶的限制受常用标记酶的限制, 实际上只能实际上只能直接用直接用2 2个不同酶标记的一抗个不同酶标记的一抗 显示相应的显示相应的2 2个抗原。个抗原。2)2)间接法间接法: : 由于需用三套或三套以上抗体系统，抗体间存在交叉反应的可由于需用三套或三套以上抗体系统，抗体间存在交叉反应的可 能性大，非特异性反应强，因此最好的方法是在完成每套抗体能性大，非特异性反应强，因此最好的方法是在完成每套抗体 显示各自抗原后，用微波处理灭活各套抗体显示各自抗原后，用微波处理灭活各套抗体, ,再进行后

52、续不同套再进行后续不同套 抗体显示后续的各个抗原。抗体显示后续的各个抗原。 此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。三）三）免疫酶及免疫荧光双重及多重染色免疫酶及免疫荧光双重及多重染色 一般先进行免疫酶染色，再进行免疫荧光染色。一般先进行免疫酶染色，再进行免疫荧光染色。由于通常只有由于通常只有 红、绿、棕、蓝（或紫）红、绿、棕、蓝（或紫）4 4种颜色可用，故至多只能进行种颜色可用，故至多只能进行1-21-2种种 免疫组化染色和免疫组化染色和2-32-3种免疫荧光染色的组合。种免疫荧光染色的组合。免疫组化与原位杂交38 原位杂交原位杂交 也

53、被称作原位杂交组织化学也被称作原位杂交组织化学(in situ hybridization histo-(in situ hybridization histo-chemistrychemistry），简称），简称原位杂交原位杂交(in situ hybridization,ish)(in situ hybridization,ish)和荧和荧光光原位杂交原位杂交(fluorescein in situ hybridization,fish)(fluorescein in situ hybridization,fish) 一、基本原理一、基本原理 ： 利用两条互补的单核苷酸链，在适当的温度和离

54、子浓度下，通过利用两条互补的单核苷酸链，在适当的温度和离子浓度下，通过 互补互补碱基对之间的氢键紧密结合，形成稳定的杂交双链的特性，碱基对之间的氢键紧密结合，形成稳定的杂交双链的特性， 将带有标记物的已知将带有标记物的已知核酸某段核酸某段碱基序列做为探针，与标本中的相碱基序列做为探针，与标本中的相 应核酸进行特异性结合，再应用与标记物相应的检测系统，通过应核酸进行特异性结合，再应用与标记物相应的检测系统，通过 荧光荧光、免疫酶染色或放射性核素显示杂交信号，进行免疫酶染色或放射性核素显示杂交信号，进行相应相应核酸在核酸在 细胞内的定位及定量。细胞内的定位及定量。 二二、探针的制备：、探针的制备：

55、 免疫组化与原位杂交39一）探针的种类一）探针的种类1.1.基因组基因组dnadna探针：探针： 是使用最广泛的探针是使用最广泛的探针, ,可通过限制性内切酶酶切和可通过限制性内切酶酶切和pcrpcr方法获得。方法获得。 由于此类探针是双链由于此类探针是双链dna,dna,使用前必须进行变性处理。使用前必须进行变性处理。2.cdna2.cdna探针：探针： cdnacdna是互补于是互补于mrnamrna的的dnadna分子分子, ,可从可从cdnacdna文库中克隆获得文库中克隆获得, ,也可通也可通 过过rt-pcrrt-pcr方法获得，由于此类探针也是双链方法获得，由于此类探针也是双链d

56、na,dna,使用前也必须使用前也必须 进行变性处理。进行变性处理。3.3.寡核苷酸探针：寡核苷酸探针： 通过化学合成技术合成的单链通过化学合成技术合成的单链dnadna，一般长度为，一般长度为20-50bp20-50bp。 以上都是以上都是dnadna探针，由于探针，由于dnadna与与dnadna或或rnarna的结合效率低，故敏感性的结合效率低，故敏感性 低，且无法做正义低，且无法做正义(sense)(sense)和反义和反义(antisense)(antisense)探针的对照实验，探针的对照实验， 一般用于一般用于dnadna的杂交检测。的杂交检测。免疫组化与原位杂交40 4.crn

57、a 4.crna探针：探针： crnacrna探针是以探针是以cdnacdna为模板在体外转录而成的单链为模板在体外转录而成的单链rnarna探针。由于探针。由于 它是它是rnarna，与，与dnadna或或rnarna的结合效率高，故敏感性高，并可做的结合效率高，故敏感性高，并可做sensesense 和和antisenseantisense探针的对照实验，常用于探针的对照实验，常用于mrnamrna的杂交检测的杂交检测, ,也可用于也可用于 dnadna的杂交检测。的杂交检测。二）探针的标记二）探针的标记1.1.探针的标记物：探针的标记物： 标记物被标记在核酸标记物被标记在核酸(ntp)(

58、ntp)或脱氧核酸或脱氧核酸(dntp)(dntp)上，随上，随rnarna或或dnadna的的 合成而掺入。合成而掺入。1 1）放射性标记物：）放射性标记物： 常用的放射性标记物是常用的放射性标记物是3232p(p(磷磷) )、3 3h(h(氚氚) )和和3535s(s(硫硫) )。2 2）非放射性标记物：）非放射性标记物： 常用的非放射性标记物是常用的非放射性标记物是digoxigenin(digoxigenin(地高辛地高辛) )、fluoresceinfluorescein isothiocyanate isothiocyanate（fitcfitc，异硫氰酸荧光素）和，异硫氰酸荧光素

59、）和biotin(biotin(生物素生物素) )。免疫组化与原位杂交412.2.探针的标记方法：探针的标记方法：1)dna1)dna探针的标记方法探针的标记方法: :缺口平移法缺口平移法(nick translation)(nick translation)随机引物法随机引物法(random primer)(random primer)免疫组化与原位杂交42末端标记法末端标记法(end-labelling)(end-labelling)b)t4b)t4聚合酶替代法聚合酶替代法a)3a)3末端标记法末端标记法免疫组化与原位杂交43pcrpcr扩增标记法扩增标记法2)rna2)rna探针的标记方

60、法探针的标记方法: :55末端标记法末端标记法免疫组化与原位杂交44rnarna体外转录法体外转录法三、三、mrnamrna原位杂交原位杂交( (非放射性探针非放射性探针) )基本程序基本程序一）标本的制备一）标本的制备免疫组化与原位杂交451.1.组织标本的取材组织标本的取材 取材原则取材原则: :尽可能快的切取所需组织浸入固定液尽可能快的切取所需组织浸入固定液, ,保持组织的新保持组织的新 鲜以最大限度地防止细胞内鲜以最大限度地防止细胞内mrnamrna或或dnadna的降解的降解, , 有条有条 件的最好在冷库取材。件的最好在冷库取材。2.2.固定固定 固定液用量应是标本的固定液用量应是标本的4