原料预处理技术

1、模块二：相关的分离纯化技术模块二：相关的分离纯化技术子模块一：原料的预处理技术子模块一：原料的预处理技术复习提问复习提问简述糖酵解的意义？简述糖酵解的意义？1mol1mol葡萄糖彻底氧化生成多少葡萄糖彻底氧化生成多少ATPATP？新课导入新课导入我们如何从我们如何从生物体中提生物体中提取出生物活取出生物活性大分子？性大分子？生物技术下游加工过程的一般生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作流程和单元操作培养液（发酵液）的预处理和固液分离；培养液（发酵液）的预处理和固液分离；初步纯化（提取）；初步纯化（提取）；高度纯化（精制）；高度纯化（精制）；成品加工。成品加工。一般下游加工过程可分为一般下游

2、加工过程可分为4个阶段个阶段 下游加工过程的一般流程下游加工过程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液发酵液初步纯化初步纯化细胞碎片分离细胞碎片分离细胞破碎细胞破碎细胞分离细胞分离高度纯化高度纯化成品加工成品加工预处理预处理胞外产物胞外产物（加热、调（加热、调pH、絮凝）、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）（浓缩、无菌过滤、

3、干燥、成型）胞外产物胞外产物提取提取精制精制产品的收得率和质量控制产品的收得率和质量控制。影响其纯化的因影响其纯化的因素是什么？素是什么？影响发酵液后处理的主要因素粘度粘度, ,杂蛋白杂蛋白n影响树脂对产物的吸附能力；影响树脂对产物的吸附能力；n在萃取操作中，易产生乳化，不利在萃取操作中，易产生乳化，不利 于两相的分离；于两相的分离；n污染滤膜，降低滤速污染滤膜，降低滤速高价无机离子高价无机离子 当采用离子交换法提取产物时，影响当采用离子交换法提取产物时，影响树脂对生化物质的交换容量树脂对生化物质的交换容量降低发酵液粘度去除杂蛋白目的目的n不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞不仅在于分离

4、细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物），碎片、核酸和蛋白质的沉淀物），n还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。以利于后继各步操作。采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；的大小，提高其沉降速度；或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。发酵液的预处理发酵液的预处理一、发酵液过滤特性的改变一、发酵液过滤特性的改变微生物发酵液的特性为：微生物发酵液的特性为：发酵产物浓度较低，大多为发酵产物浓度

5、较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水；，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。蛋白酶水解等作用的影响。微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋存的固体培养基外，还有未被

6、微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。白质，以及微生物的各种代谢产物。改善发酵液过滤特性的物理化学方法：改善发酵液过滤特性的物理化学方法：调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。解冻及添加助滤剂等。根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。注意加热液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率

7、。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值值可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个某个pH值下也

8、可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。n凝聚凝聚指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定

9、的现象；n絮凝絮凝指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。使胶粒形成较大絮凝团的过程。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+常用的凝聚剂电解质有：常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；（明矾）；氯化铝氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁硫酸亚铁 FeSO47H2O ；石灰；石灰；ZnSO4；MgCO3（1）凝聚）凝聚 发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体

10、粒子双电层发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。 絮 凝定义： 是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使细胞聚集形成粗大的絮凝团的过程。1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；烯类衍生物；2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。明胶、骨胶

11、、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。目前最常见的高分子聚合物絮凝剂目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺（有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物）类衍生物根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类： 非离子型、非离子型、 阴离子型（含有羧基）阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）阳离子型（含有胺基）工业上使用的絮凝剂可分为三类：工业上使用的絮凝剂可分为三类：聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点优点l 用量少，一般以用量少，一般以mg/L计量；计量；l 絮凝体粗大，分离效果好；絮凝体粗大，分离效果好；l 絮凝速度快；絮

12、凝速度快；l 种类多，适用范围广。种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点缺点u存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。用于食品和医药工业时应谨慎。聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用应用n 医药和食品工业：医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、机

13、高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。脱乙酰壳多糖等）。聚丙烯酰胺絮凝剂聚丙烯酰胺絮凝剂n对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；附桥架的双重机理；n对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。和絮凝机理的过程，称为混凝。一种不可压缩的多

14、孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。滤阻力。常用的助滤剂有：常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。最常用的是硅藻土。使用硅藻土时，通常细粒用量为使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m3；中等粒度用量为；中等粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为粗粒用量为700-1000 g/m3。加入反应剂和某些可溶性盐

15、类发生反应生成不溶性沉淀，如加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，的淀粉酶，搅拌搅拌30min后，

16、再加后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。倍。 发酵液中的杂质发酵液中的杂质 高价无机离子（高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+） 杂蛋白杂蛋白在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。u在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，u在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。u在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。在

17、常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。 因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。二、发酵液的相对纯化二、发酵液的相对纯化（一）、高价无机离子的去除方法（一）、高价无机离子的去除方法 Ca2+ 草酸、草酸钠，草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀（注（注意回收草酸）意回收草酸） ； Mg2+三聚磷酸钠，三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；溶性络合物； Fe2+ 黄血盐，黄血盐，普鲁士兰沉淀普鲁士兰沉淀（二）杂蛋白的去除方法（二）杂蛋白的去除方法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液

18、中。l在酸性溶液中带正电荷；在酸性溶液中带正电荷；l在碱性溶液中带负电荷。在碱性溶液中带负电荷。在某一在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。1. 沉淀法沉淀法l在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；淀；l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和和Pb+等形成沉淀。等形成沉淀。A. 酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀

19、。酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。2. 变性法变性法 加热，加热， 大幅度调节大幅度调节pH值，值， 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处不足之处加热法只适合于对热较稳定的目的产物；加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸

20、附蛋白质；作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。性粒子吸附并包裹在其中除去。 3. 吸附法吸附法 重力沉降重力沉降 浮选浮选 旋液分离旋液分离 介质过滤介质过滤 离心离心通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。用于固液比重差小、直径用于固液比重差小、直径530m m颗粒的分离，污水处理颗粒的分离，污水处理悬浮液以较高速度沿切线方向进入悬浮液以较

21、高速度沿切线方向进入旋风分离器旋风分离器，轻相由分离器中央排出，轻相由分离器中央排出，重相由分离器下部排出，重相由分离器下部排出，但不适合直径但不适合直径5 m颗粒去除（可用丝网分离器）。颗粒去除（可用丝网分离器）。工业上常用工业上常用霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法；过滤方法；细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。用过滤进行固液分离。二、固液分离的方法二、固液分离的方法优点：分离速度快

22、，分离效率高、液相澄清度好；优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；缺点：设备投资高、能耗大。缺点：设备投资高、能耗大。离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。1. 离心分离离心分离在液相非均一系统中，利用离心力达到液液、液固、在液相非均一系统中，利用离心力达到液液、液固、液液固分离的方法，统称为离心分离。液液固分离的方法，统称为离心分离。离心分离因数离心分离因数f=Gu2gRGgR(2Rn)260GRn2900=GDn21800重量重量kg旋转旋转直径直径转速转速r/min微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的

23、固体培养基成分。微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。与液体进行分离的过程。在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收率。并且有高的收率。2. 过滤过滤过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体含量少于含量少

24、于0.1g/100ml、颗粒直径在、颗粒直径在5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。芽汁、酒类和饮料等的澄清。过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方法叫做滤饼过滤，在滤

25、饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用，法叫做滤饼过滤，在滤饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用，适合于固体含量大于适合于固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液的过滤分离。的悬浮液的过滤分离。B. 常用过滤设备常用过滤设备（1）板框压滤机）板框压滤机优点优点过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。对不同过滤特性的发酵液适应性强。缺点缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。件差，非过滤的辅助时间较长。广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量固体含量1-10%的悬浮液的分离。的悬浮液的分离。 单元组成单元组成板板布布板板布布板板