引物设计及测序结果分析

1、（primer design） 3.1 引物设计引物设计 引物的定义引物的定义引物（引物（primer）是一段短的单链是一段短的单链DNA或或RNA片段，可结合在片段，可结合在DNA模板链上与之互补的区域，作为模板链上与之互补的区域，作为DNA复制的起始点。复制的起始点。体外人工设计的引物被广泛用于体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR )、测序和探针合成等。、测序和探针合成等。引物设计是引物设计是PCR技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到PCR的特异性和实验能否成功。的特异性和实

2、验能否成功。 DNA模板模板95（解链解链）60（退火）与引物结合退火）与引物结合72（延伸）延伸）DNA单链单链Taq酶，酶，dNTPs, Mg2+Forward primerReverse primerPCR的基本原理的基本原理三步循环：三步循环：变性、退变性、退火、延伸火、延伸1.变性：变性：双链双链DNA解解链成为单链链成为单链DNA2.退火：退火：部分引物与部分引物与模板的单链模板的单链DNA的特的特定互补部位相配对和定互补部位相配对和结合结合3.延伸延伸：以目的基因：以目的基因为模板，合成互补的为模板，合成互补的新新DNA链链 GTGATGTTCCTGACGGTACTCTAAAGT

3、CACCGTGGACGGACC 5 3 5 CACTACAAGGACTGCCATGAGTAAAGTCACCGTGGACGGACC 5 Reverse primer/anti-sense primer : 5 CCAGGCAGGTGCCACTGAAAT Forward primer/sense primer: 5 CACTACAAGGACTGCCATGAGCACTACAAGGACTGCCATGAGATTTCAGTGGCACCTGCCTGG 5 3 PCR RrimersM500bp700bp900bp1200bp61 63 65NC100bp300bp琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测PCRP

4、CR产物（产物（1 1） 5GCAGTACATGTC 33 c g t c a t g t a c a g 5编码链编码链(CDS)模板链模板链mRNA5GCAGUACAUGUC 3转录转录NAla Val His Val C蛋白质蛋白质翻译翻译DNA模板链、编码链与转录及翻译的关系模板链、编码链与转录及翻译的关系反转录反转录CDS（coding sequence）是编码一段蛋白产物的是编码一段蛋白产物的DNA序序列。一般以列。一般以ATG开始，以开始，以TAA、TAG、TGA结尾。结尾。cDNA （complementary DNA）是与是与RNA链碱基互补的链碱基互补的单链单链DNA，或此

5、，或此DNA链与其碱基互补的链与其碱基互补的DNA链所形链所形成的成的DNA双链。双链。PCR 模板模板:cDNA一、引物设计流程一、引物设计流程序列查找和下载序列查找和下载序列同源性比较序列同源性比较引物设计与筛选引物设计与筛选引物的评价分析引物的评价分析引物的二次筛选引物的二次筛选引物的最终评估引物的最终评估引物加工与修饰引物加工与修饰二、引物设计原则二、引物设计原则引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体引物与引物之间避免形成稳定的二聚体(dimer)或发夹结构或发夹结构(hairpin)引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位

6、点引发DNA 聚合反聚合反应应(即错配即错配) （一）基本原则（一）基本原则1 1、引物的长度、引物的长度 一般一般151530bp30bp，常用，常用181824 bp24 bp。引物过短容易引起错配现象，引物过长会导致引物过短容易引起错配现象，引物过长会导致PCRPCR延伸温度大于延伸温度大于7474，不适于，不适于TaqTaq DNA DNA聚合酶。聚合酶。 （二）一般原则（二）一般原则2、引物扩增跨度引物扩增跨度即产物长度，以即产物长度，以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长为宜，特定条件下可扩增长至至10kb的片段。的片段。3、引物的特异性引物的特异性在模板在模板cDNA的保守

7、区内设计引物。的保守区内设计引物。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。酸的成串排列。引物引物3端的碱基分布端的碱基分布引物引物3端最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对端最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对引物引物3端最好以端最好以C或或G结尾，避免使用结尾，避免使用A引物引物3端避免出现端避免出现3 个以上连续的个以上连续的C或或G,如如GGG 或或CCC引物引物3端端5个碱基个碱基G+C不宜超过不宜超过3个个4、引物的碱基分布引物的碱

8、基分布G G 值是指值是指DNADNA双链形成所需的自由能，反映了双链结构内部碱基双链形成所需的自由能，反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。对的相对稳定性。 3 端端G G 值值应较低，否则易引起错配。应较低，否则易引起错配。5、引物的引物的GG值值 hairpin6、引物的互补情况引物的互补情况引物自身及引物之间不宜存在互补序列。如果引物自身折叠成引物自身及引物之间不宜存在互补序列。如果引物自身折叠成发发夹结构（夹结构（HairpinHairpin），），会因空间位阻而影响引物与模板的结合。会因空间位阻而影响引物与模板的结合。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过引物二聚体及发夹结构的能值过

9、高（超过4.5Kcal/mol4.5Kcal/mol）, ,易导致易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度, ,使使PCRPCR反应不能正常反应不能正常进行。进行。Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC 3 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA 5 Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC 3 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA 5 引物自身形成二聚体引物自身形成二聚体（self-dimer）上下游引物之间二聚体（上下游引物之间二聚体（cross

10、 dimercross dimer）Reverse primer : 5 CTGTGCTCTCTCATCATCATATTCForward primer: 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAAGillM 57 59 61 63 65Kindey 57 59 61 63 65NC900bp700bpTarget segment: 813 bp琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测PCRPCR产物（产物（2 2） dimer7 7、引物的、引物的GCGC含量含量 G+C含量以含量以40-60%为宜。为宜。 G+C太少，太少，PCR扩增效扩增效果不佳；果不佳；G+C过多，易出现非特异条带。过

11、多，易出现非特异条带。 8 8、引物的、引物的TmTm合理的退火温度为合理的退火温度为5570两引物的两引物的Tm 值相差不应大于值相差不应大于5 Tm值值(解链温度解链温度)=4(G+C)2(A+T) 退火温度退火温度=Tm值值-59、引物的修饰情况引物的修饰情况 引物的引物的5端可以修饰，而端可以修饰，而3端不可修饰端不可修饰。 引物引物5 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。入突变、缺失突变序列；引入启动子序

12、列等。在计算在计算Tm值时不必考虑附加序列，但在检测互补及二级结值时不必考虑附加序列，但在检测互补及二级结构时要加上它们。构时要加上它们。 常用引物设计软件：常用引物设计软件：lPrimer Premier 5.0Primer Premier 5.0lPrimer 3Primer 3lDNAmanDNAmanlOligo 6Oligo 6（引物评估软件）（引物评估软件）三、引物设计软件三、引物设计软件（一）序列查找和下载（一）序列查找和下载 //nuccore/NC_003495.1http

13、://nuccore/19881396?from=455&to=3511/nuccore/19881396?report=fasta&from=455&to=3511将查找到的将查找到的CDS序列以序列以.txt文件保存文件保存将查找到的将查找到的CDS序列以序列以.seq文件保存文件保存将查找到的将查找到的CDS序列以序列以.seq文件保存文件保存（二）序列同源性比较（二）序列同源性比较1 1、利用在线的、利用在线的NCBINCBI中的中的BLASTBLAST工具进行比较工具进行比较2 2、利用、利用

14、DNAmanDNAman等软件进行多序列比较等软件进行多序列比较序列比对序列比对参数一般默认参数一般默认序列比对结果序列比对结果（三）引物设计与筛选（三）引物设计与筛选Load sequence1 1、利用、利用Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 软件设计引物，扩增软件设计引物，扩增BPMV BPMV CPCP基基因片段。因片段。 Primer Premier Primer Premier 启动界面启动界面Press OK导入已知的导入已知的BPMV BPMV CPCP基因的基因的CDS(coding sequence)CDS(coding sequen

15、ce)序列序列note：存储的文件存储的文件路径及名称不能含路径及名称不能含有中文。有中文。序列导入结果显示窗口序列导入结果显示窗口在目的序列的在目的序列的第一个第一个碱基碱基处双击处双击GenbankGenbank窗口窗口点击点击“primer”primer”按钮按钮点击点击“search”“search”按钮按钮引物搜索选项设定引物搜索选项设定Press “OK”搜索结果搜索结果Press “OK”点击选中一对引物点击选中一对引物搜索结果窗口搜索结果窗口引物设计窗口引物设计窗口挪开挪开“Search Results”窗口窗口引物数据的保存引物数据的保存引物数据库窗口引物数据库窗口1.按按“

16、Ctrl”，选择引物，选择引物2.点击点击“Export”3.引物已输入到引物已输入到数据库中数据库中引物合成订单引物合成订单选择引物，点击菜单栏选择引物，点击菜单栏“Function”Function” “order form” order form” “new form” ,new form” ,弹出弹出 “Synthesis order form”Synthesis order form”窗口窗口考核操作题（一）考核操作题（一）自行在自行在NCBINCBI核酸数据库内检索一个基因核酸数据库内检索一个基因CDSCDS序列序列( (长度长度大于大于500bp)500bp)，完成下列操作（，完成下列操作（1