microRNA的实时定量茎环RTPCR技术

1、microrna的实时定量茎环rt-pcr技术摘要： 已开发出一种新型的microrna（mirna）的定量方法，即利用茎环反转录，taqman pcr分析。茎环rt引物在rt 效率和特异性方面比传统的更好。taqman mirna的检测是很具体的，可以检测成熟mirna和区分相关的甚至低至一个核苷酸的mirnas。此外，他们不会受到基因组dna污染的影响。精确量化可以从低至25皮克的总rna中提取大多数mirna。事实上，这种方法灵敏度高，特异性强和精密度高，允许无需核酸纯化，直接分析单个细胞。如标准taqman基因表达分析，taqman mirna的检测显示出了7个数量级的动态范围。七个小

2、鼠组织中五个mirna定量显示，在每个细胞中，有低至10到超过30000个拷贝数。这种方法可以确保快速，准确，灵敏mirna表达谱，并能识别和监控特定组织或疾病的潜在生物标志物。茎环rt-pcr可用于其他小rna分子，如短干扰rna（sirnas）的量化。此外，为更好的特异性和效率，茎环rt引物设计的概念可以应用在小分子rna克隆和多重检测。引言： mirna是自然发生的，高度保守的转录家庭，来源于较大的发夹前体。mirna是在动物和植物的基因组上发现的。到目前为止，有1000个独特的转录产物，其中，在桑格中心mirna的注册表中包括326人类mirna。 mirna是通过催化mrna的分裂或

3、抑制mrna的翻译来调节基因表达。他们被认为在细胞发育，分化和传导中发挥着重要作用。具体职责包括调节细胞增殖和新陈代谢，发育时间，细胞死亡，造血，神经发育，人类肿瘤形成与dna甲基化和染色质修饰。 虽然mirna的相对丰富的转录产物类别，其表达水平在物种和组织之间相差很大。低丰度的mirna经常逃避检测技术，如克隆，northern杂交和基因芯片分析。这里，我们提出一种新型实时定量方法，能够准确灵敏地检测mirna与其他小分子rna。这种方法扩展了实时pcr技术，从大分子的基因表达到微分子的变化检测。材料和方法 从桑格中心的mirna注册网站 http:/www.sanger.ac.uk/so

4、ftware/ rfam/mirna/index.shtml中筛选目标，引物和探针。所有taqman mirna检测，可通过应用生物系统公司（p / n4365409）得到。mirna标准taqman分析，采用primerexpress软件设计pri-let-7a-3和pri-mir-26b和mirna前体mir-30a。所有序列在补充资料部分可用。合成mirna的寡核苷酸从integrated dna technolo-gies (idt, coralville, ia)购买。rna样本组织，细胞，细胞裂解物和总rna制备 从ambion公司（p / n7810，7812，7814，7816

5、，7818，7824，7826和7968）购买10-12天老鼠的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎的总rna样品。 ambion公司鼠的总rna来自瑞士韦伯斯特小鼠。基于taqman基因表达分析人类或小鼠的3 - 磷酸甘油醛脱氢酶（gapdh）内对照（p / n4310884e4352339e，应用生物系统公司）所有的rna样品进行标准化。 两个细胞株hepg2和op9，培养，使用gibco公司mem（p / n 12492-021，invitrogen，carlsbad, ca）补充10胎牛血清（fbs）(p/n: sh30070.01, hyclone, logan, ut)培养。用血球计对

6、胰酶消化细胞计数。约2.8106个悬浮细胞通过离心沉淀，1500r.p.m.离心5分钟，用1毫升不添加 mgcl2 and cacl2的杜尔贝科的磷酸盐缓冲液（pbs）洗涤。细胞再悬浮于140毫升pbs，并用三种不同的样品制备方法处理。第一种方法，一个50毫升的样本（106个细胞）等量的核酸纯化裂解液混合，用吸管反复吹打十次，然后旋转。在添加到rt反应体系前，将裂解液用1 u / ml的rnase抑制剂溶液稀释1/10。在第二种方法中，用mirvanamirna提取试剂盒提取50毫升的样本（106个细胞）。纯化的总rna在100毫升洗脱缓冲液中洗脱。第三种方法用1pbs稀释1/2，95加热5分

7、钟，在加入rt反应体系前立即在冰上保存。用mirvana mirna检测试剂盒检测mirna 根据制造商的协议，使用mirvana-mirna的检测试剂盒对mirna杂交分析。由idt合成rna探针。放射性同位素标记的rna片段用气旋存储荧光粉系统进行检测和定量。反转录酶反应 逆转录反应中包含的rna样品，包括纯化总rna，细胞裂解物，和热处理细胞，50纳米的茎环rt引物，1rt缓冲液，每dntps浓度0.25毫米，3.33 u / l 的逆转录酶和0.25 u / l的rnase抑制剂。7.5微升反应体系在9700温度循环器96- 或 384-平板上16培养30分钟，4230分钟，855分钟

8、，然后保持4。所有逆转录反应，包括无模板对照和rt负对照，都进行一次重复。pcr 采用标准的taqmanpcr试剂盒进行实时pcr。 10lpcr反应体系包括0.67lrt产物，1taqman mix ，0.2m的taqman探针，1.5m m正向引物和0.7m反向引物。反应在 384-平台上95培养10分钟，9515秒601分钟40个循环。所有的反应一式三份。 c t为在荧光通过固定阈值的循环数。荧光定量ct值转换成绝对数量的拷贝数，使用合成林-4 mirna的标准曲线。结果 我们提出了一个新的mirna的定量的实时rt-pcr技术方案。它包括两个步骤：rt和实时pcr。首先，茎环rt引物是

9、与mirna分子杂交，然后用multi-scribe反转录。接下来，用传统的taqman pcr，对rt产品进行定量。图1。上图描述的是taqman mirna的检测原理，基于taqman实时定量mirna的包括两个步骤，茎环rt和实时pcr。茎环rt引物结合在mirna分子的3端和用反转录酶逆转录。然后，rt产品使用传统的taqman pcr定量，其中包括特定mirna的正向引物，反向引物和染料标记的taqman探针。尾正向引物5的作用是根据mirna分子的序列组成增加其熔融温度（tm）。图2。taqman-4 mirna的检测的动态范围和灵敏度。 （a）4超过7个数量级的 lin-4 mi

10、rna扩增曲线。合成的rna输入范围从1.3103 fm（相当于每次反应7个拷贝数） 1.3104 fm（相当于每次反应7107拷贝数）；（b）lin-4 mirna的标准曲线。 mirna定量的动态范围和灵敏度的计划使用一种人工合成的cel-lin-4靶进行首次评估。合成的rna在 a26值的基础上量化，稀释超过7个数量级。 cel-lin-4 taqman mirna的检测结果显示在目标输入和ct值之间有极好的线性关系，表明，该检测有至少7个动态范围，并能够检测pcr反应中少于7个的拷贝数（图2）。 采用小鼠肺总rna的八个额外mirna的检测也被证实。rna的输入范围从0.025到250

11、纳克（图3）。 相关的rna输入的thect 值超过4个数量级（r20.994）。阴性对照检测中，即使在250纳克总rna鼠标的反应中，cel-mir-2没有给出一个检测信号。 根据七个不同的鼠组织中五个mirna的表达谱测定，创建一个mirna的表达图谱。每个细胞中的拷贝数根据输入的总rna（假设15皮克/细胞）和合成lin-4目标的标准曲线计算。从这个表达图谱上作了一些有趣的观察。首先，mirna非常丰富，组织中每个细胞平均有2390个拷贝数。每个细胞表达的拷贝数在10-32090之间变化。在所有组织中，12个mirna里，mir-16和mir-323是最丰富和最低量表达的mirna。此外

12、，每个组织都有独特的mirna的表达水平。mirna表达的整体水平在小鼠肺中最高和胚胎中最低。最后，在7个组织中，mirna表达的动态范围变化很大，从不到5倍(let-7a)到超过2000倍(mir-323) （表1）。 评估rna分离的需要，我们直接在mirna的检测中增加了细胞裂解物。相当于直接在7.5毫升逆转录反应中添加2.5-2500细胞。当检测到，在一些细胞中ct值相关r20.998）的rt反应至少有三个数量级（图4）。 图3。总rna输入的阈值循环（ct）值检测8个mirna的相关性。每rt反应中，小鼠肺总rna输入范围从0.025到250纳克。将新杆状线虫的mirna（mir-2

13、）列入作为阴性对照。 鼠或人的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎（10-12天）的总rna样品均购自ambion公司。根据标准曲线lin-4合成的mirna对每个细胞拷贝数进行估计。每个rt反应中添加150ng的rna（或相当于约10 000个细胞，假设每个细胞中有15pg总rna）。依据taqman磷酸甘油醛脱氢酶的内对照（p / n4352339e）将rna规范化输入。 检测了12组非特定的基因组dna对taqman mirna的影响。结果表明，rt反应中是否添加5纳克人类基因组dna对ct值没有影响，表明rna的目标（数据未显示）检测是非常特异的。基于这一观察，我们直接mirna定量检测中

14、增加了热处理细胞。图5显示了使用纯化总rna，细胞裂解物，从同样数目的hepg2细胞得到的热处理细胞的mirna进行定量比较。直接添加热处理细胞的mirna的检测ct值最低，和其他三种不同的样品制备方法相似。 图4。使用op9细胞裂解物检测taqman mirna的动态范围。 每个rt体系中输入细胞数范围为3至2500个细胞。采用新杆状线虫elegans mirna（mir-2）作为阴性对照。 图5。对热处理细胞，细胞裂解液和10 mirna实时定量总rna进行比较。用阈值循环（ct）来衡量mirna的表达水平。每pcr扩增约400 hepg2细胞进行了分析。 图6。的taqman mirna

15、mir-16的分析比较来解决以印迹杂交为基础的分析。总rna来自小鼠肾，肝，肺，脾和睾丸组织。 由两个独立运行系统（数据未显示）对12 mirna16重复检测taqman mirna的可再现性。ct的标准偏差平均为0.1，显示检测的高精度。 我们采用一个独立的技术，这个技术是基于杂交印迹的mirna分析，比较taqman mirna的检测（图6）。我们观察到杂交为基础的mirna分析重复性差，在从目标到目标的变化中和taqman分析一致。五个鼠组织样本中的mir-16的两种方法（r2= 0.916）一致。然而，在低丰度的mirna中相关性相对较低，如mir-30的（r2= 0.751）。 杂交

16、的方法对成熟的mirna来讲缺乏特异性。我们调查了taqman mirna区分成熟mirna和较长的前体的检测能力，合成pri-mirna前体，pri-mir-26b和pri-let-7a和pre-mirna 前体pre-mir-30a（见表2）。 taqman分析旨在检测前体和成熟的mirna进行合成平均1.5的目标108rt反应副本（每pcr体系1.3107拷贝数）。仅pri-mirna前体分子的taqman mirna的分析产生了较成熟的mirna的分析高出至少11个循环的ct值。这一结果意味着，如果成熟的mirna和前体在浓度相同，后者将在检测成熟的目标时贡献0.05的背景信号。对于p

17、re-mir-30a来讲，成熟的mirna mir-30a-3p定位于在pre-mir-30a序列3末端，观察到8.4 ct的差异。结果表明，对于成熟mirna来说，taqman mirna的检测是特异的。然而，如果mirna位于pre-mirna前体链5端，特异性分析更好。总rna实验分析代替合成目标，表明，前体与成熟mirna相比，至少丰富度小于两个数量级，基于ct 在mir-26b-1 和 let-7a-2前体的差异多于7个或7个以上数量级。一并考虑，这些结果表明，对于成熟mirna来说，taqman mirna的检测更加特异。 图7。let-7 mirna的检测鉴别力。相对检测（）计算

18、是基于ct完全匹配和不匹配的目标之间的差异。在rt反应中添加合成rna的1.5108 拷贝数。估计浓度在a260 值的基础上。 taqman mirna的检测能力不同，是依据采用let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和let-7e 5个合成mirna来检测低至一个核苷酸（图7）。每个mirna的检测对应每个mirna。相对探测效率是通过计完全匹配和不匹配的目标ct之间的差异，假设完美匹配的效率为100。观察非特异性信号处在非常低的水平，从零到0.3，对于mirna有2-3不匹配，0.1-3.7的单核苷酸不同。许多交叉反应，是由rt反应反应中g-t的错配导致的。如果mir

19、na之间出现超过三个不匹配，会有针对性的mirna检测。 我们比较歧视的taqman mirna的检测能力的不同，以解决杂交分析为基础的检测（图8）。在我们的手中，杂交方法可以很好地区分let-7a和let-7b。然而，在let-7a, let-7c 和 let-7d之间，几乎没有区别，而是由13 nt区分。 我们推测，茎环引物可能会比线性引物提供更好的rt效率和特异性。依据茎环的堆放可能加强rna-dna的热稳定性。此外，与传统的线性rt引物，茎环的空间约束可能会提高检测的特异性。我们比较的茎环和线性rt引物合成mirna let-7a的灵敏度和特异性(图 9)。我们观察到了茎环rt几个优势

20、。首先，在合成let-7a目标时，线性和茎环rt方法ct值有7个数量级不同，表明茎环rt的效率高出至少100倍。其次，茎环rt在区分mirna之间不同时，是基于ct值两个原则的不同。最后，依据7个数量级ct，对于区分成熟的mirna和其前体，茎环rt至少好100倍。discussion讨论 由于mirna的发现，这些基因家族的特征的显著进展已经描绘了基因调控中mirna功能的机制。因此，识别mirna的生物标记特定的组织类型或疾病状态的广泛的研究已经开始。这些研究将会受益于mirna准确识别和量化方法。 当前检测和量化mir-nas的方法主要基于克隆，northern杂交，或引物延伸。尽管芯片可以提高mirna谱的产量，该方法在灵敏度和特异性方面有着是相对的局限性。对于mirna的定量，灵敏度低已成为一个的问题，因为很难放大这些短的rna目标片段。此外，特异性低，可能会导致密切相关的mirna、前体和基因组序列的错误的积极信号。最近，已报道了针对mirna量化的修改后的侵袭物检测。然而，侵袭物检测特异性和敏感性有限，每检测至少需要50 ng总rna，或1000裂解