大肠杆菌的培养

1、大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白腺培养基的配方:液体培养基牛肉膏3. Og蛋白豚10. Og氯化钠5. Og水1000mlpH固体培养基在液体培养基的基础上再加入 的琼脂试管斜面与平板的制备（1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白月东、牛肉膏、氯 化钠、琼脂、水放入烧杯中。（2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅 匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后， 补充水到所需的总体积。将称量好的琼脂放入已溶的药 品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。（3）调PH在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始 PH,如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入lmol/L NaOH,

2、边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到。反之 用lmol/L HC1进行调节。（4）分装 将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管 装量不超过管高的1/5,三角烧瓶的量不超过1/2加塞培 养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。(5) 包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层 牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名 称、配制日期。(6) 灭菌 将上述培养基以,121C, 15min高压蒸气灭菌。(7) 倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三 角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。(8) 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷却至50C左右，将试

3、管 口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的 一半为宜。接种大肠杆菌斜面种子(1)取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近,用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。(2)将接种好的斜面放入37C的恒温培养箱子中培养24ho3 制备平板种子(1)在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度 稀释为I倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次吸取溶液100U1),然后在37C培养箱中过夜。(12) 次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白腋液体

4、培养基中37C, 170r/min 恒温振荡培养18h作种子培养液。其后的实验中，每次实验前从种子培养液中吸取2ml菌液接种于新鲜1111灭菌的液体培养基中，37eC, 170r/min恒温振荡培养 使用牛肉膏蛋白月东培养基 组成成分：牛肉膏3g,蛋白月东10g, Nacl 5g,琼脂1520g,水 lOOOmL,。具体配置步骤：1. 称药品按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛 肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可 放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离,立即取 出纸片.蛋白月东极易吸潮，故称量时要迅速.2. 加热溶解在烧杯中加入少于所需

5、要的水量，然后放在石棉网上，小 火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配 制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此 过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分.3. 调pH检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边 搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围.若偏碱，则用 lmol/L HC1进行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不 要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度.4. 过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过 滤，以利培养的观察但是供一般使用的培养基，这步可省

6、略.5. 分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装 时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量：固体培养基约为试管高度的1/5,灭菌后制成斜面.分装入三 角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3 为宜，灭菌后垂直待凝.6. 加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞. 棉塞的形状，大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙,才能起 到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口 或瓶口内，以防棉塞脱落有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱 布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.7. 包扎加塞后，

7、将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭 菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一 起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好.然后用记号笔注明，培养基 名称,组别，日期.8. 灭菌将上述培养基于C湿热灭菌20min.如因特殊情况不能及时灭 菌，则应故入冰箱内暂存.9. 无菌检查 将灭菌的培养基放入37C温箱中培养2448h,无菌生 长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用.大肠杆菌的培养：37摄氏度，恒温培养48到72小时，因为接种时和具体培养条件的 不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落。菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜 色一致。大

8、肠杆菌/大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养 基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的 快速检测。大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。成份(g/L)特殊营养物质混合显色剂琼脂pH 25 C此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。注意此培养基仅供实验室使用。用法称取本品 加入1000ml蒸慵水，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超 过1分钟。取lml制备好的样品液加入直径为9cm无菌平皿中心, 倾入冷却至45-50 C培养基约15ml ,混匀，凝固后，再加入一层 培养基进行履盖。或冷却至45-50 C时，倾入无菌平皿，琼脂完全 凝固后，在37 C的培养箱中倒置

9、放置1-2小时，加入适当稀释度 的样品液lml ,涂布于培养基上，36 1 C培养1824h。制备好的平板应立即使用，应避免光线直接照射。干燥培养基应放置 于阴暗干燥处，保存温度2-8 C,注意避光保存。失效干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。操作步骤1、按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液2、取样品液lml加入 冷却至45-50 C显色培养基中混匀或 涂布 于平板上3、36 1 C培养1824h ,选用有30200个菌落的平 板，计数平板上出现的典型大肠菌群和大肠杆菌菌落。大肠杆菌典型 菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色或黄色 菌落。总大肠菌群二蓝色菌落+紫色菌落+粉红色菌落大肠杆菌二蓝色菌落+紫色菌落4、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上，36 1 C 培养12-16小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验（本公司有 生化鉴定管套装20支x3种）质量控制1、外观 此干燥培养基的粉末均匀，具有良好的流动性，呈淡红色。制备好的 平板呈透明粉红色固体培养基。2、微生物试验在36 1 C培养1824h小时：质控菌株ATCC生长情况菌落颜色单增李氏菌