细胞贴壁原理

1、细胞贴壁原理悬浮细胞：细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，这类细胞称为悬浮细胞。如淋巴细胞。贴壁细胞：在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，其依靠自身分泌或培养基中的贴附因子才能在该表面生长增殖的离体动物的培养细胞。兼性贴壁细胞：有些细胞并不严格地依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长，但在一定条件下，它们还可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长，这类细胞称之为兼性贴壁细胞。贴壁细胞分为，上皮细胞型，成纤维细胞型，游走细胞型和多型细胞型，在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其它形态，而且晃动培养液时，细胞不动。悬浮细胞漂在培养液中

2、，呈圆形，晃动培养液时细胞也随着漂动贴壁生长的细胞跟悬浮的细胞都有很多种。活体体内的细胞当离体置于体外培养时大多数均以贴壁方式生长，主要包括正常细胞和肿瘤细胞，比如成纤维细胞，骨骼组织（骨及软骨），心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤神经胶质细胞，内分泌细胞，黑色素细胞及各种肿瘤细胞等。少数细胞在体外培养是悬浮生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞以及淋巴细胞。 体外培养贴壁细胞重要的生长特点有：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞

3、在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关。据资料记载，37时在2min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发生于细胞之间，而细胞与底物之间则无；8 min后才有稳定的键形成。一些特殊的促细胞附着的物质（如层粘连蛋白、纤维链接蛋白、iii型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于培养液尤其血清之中。在培养过程

4、中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态。一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长期在悬浮中生长而将逐渐退变，除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。另外，经过无血清驯化后的细胞，会从贴壁生长转到悬浮生长，目前在生物工程制药领域，趋势是使用无血清的悬浮培养为主。体外培养细胞重要的生长特点有：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，

5、在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关。据资料记载，37时在2min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发成于细胞之间，而细胞与底物之间则无；8 min后才有稳定的键形成。一些特殊的促细胞附着的物质（如层粘连蛋白、纤维链接蛋白、iii型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面或培养液尤其血清之中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因

6、子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态。一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长期在悬浮中生长而将逐渐退变，除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。摘自司徒镇强主编的细胞培养一书，具体内容见1.2 培养细胞的特性1、细胞贴壁原理 培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。细胞附着于底物时并非一种需要能量的过程，一般认为与电荷有关。据资料记载，37时在2 min内细胞之间即可形成键，该键可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发现于细胞之间，而细胞与底物之间则无；

7、8 min后才有稳定的键形成。 一些特殊的促细胞附着的物质（如层粘连蛋白、纤维链接蛋白、iii型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子（或贴壁因子）均为蛋白质，存在于细胞膜表面或培养液尤其血清之中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态。一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长期在悬浮中生长而将逐渐退变，除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。另外，经过无血清驯化后的细胞，会从贴壁生长转到悬浮生长，目前在生物工程制药领域，趋势是使用无血清的悬浮培养为主。2、贴壁细胞如何

8、分离下来？ 如果把贴壁的细胞洗下来最常用的办法就是加入胰蛋白酶消化，37环境下放置35min便可，但是残留培养瓶内的胰蛋白酶对细胞有毒性作用，所以都会添加低浓度的血清以中和胰蛋白酶的。用超声的办法也可以把细胞分离下来，但是要注意超声的频率不能太大，而且细胞很娇嫩，超声会导致细胞的破裂。这是由细胞的性质特点决定的。3、是否所有动物细胞都要贴壁生长？ 有些细胞是必须要附着在支持物上才可以生长的，比如肝细胞，胃上皮细胞等等 而有些细胞可以悬浮生长，比如骨髓细胞白，血病细胞等等这些细胞的生长都是需要添加血清的，而不是有些人说的，加入血清后会贴壁。体外培养细胞重要的生长特点：贴附和伸展以及接触抑制和生长

9、的密度限制。提高羊水细胞培养成功率的方法来自:生物01丁082007-09-27 19:43:46摘要:目的提高羊水培养的成功率。方法正常羊水保留换液标本,以备复查;异常羊水采用细胞分离技术提取羊水中的有效细胞成分;及时发现污染羊水并进行抗菌处理。结果提高了羊水培养的成功率(994% )并缩短异常羊水的培养时间,解决了部分污染羊水的污染问题(2/3)。结论保留换液标本可有效解决因收集不当而导致无法诊断的问题;细胞分离技术可提高异常羊水细胞培养的成功率并缩短培养时间,污染的羊水也可抗菌后培养成功。羊水细胞培养由于技术要求高、难度大、周期长、易污染、分裂相较少、对人员素质要求高等问题而难以普及,但

10、是羊水细胞培养及染色体制备与核型分析是产前诊断染色体病的主要手段。多年来对羊水细胞的培养及其染色体制片虽不断有所改进,但羊水细胞培养与制片的难度仍没有丝毫降低1, 7。近年兴起的基因诊断由于特异性强、设备要求高、监测范围窄、实验影响因素多等缺陷仍无法取代羊水细胞培养与核型分析在产前诊断中的价值与地位。几年来,我们针对血性羊水、胎粪、胎脂污染及细菌污染等严重影响羊水培养的成功问题进行了一些探索,并取得了比较满意的效果,现报告如下。资料与方法1.试剂与器材一次性无菌离心管和50ml的培养瓶是美国fancon公司生产的,羊水培养基为美irvinescientific公司生产changmedium c

11、专用羊水培养基,co2培养箱为formal 3131。倒置显微镜为olympus ckx-41。2.对象经产前筛查评估结果为高风险发病率的孕妇或有其它产前诊断指征、孕周在1627w的孕妇。3.羊水采集方法b超定位后,常规消毒,采用22号pie穿刺针穿刺,最初用5ml注射器抽取约2ml羊水弃去,再换一20ml注射器抽取羊水约20m,l注入两个1次性的无菌离心管中,标本尽快送实验室接种。4.一般羊水的处理方法正常的羊水与轻度血性羊水以12001300rpm离心10min,弃去上清液,保留0. 5ml羊水,轻轻混悬细胞,以备接种用。5.严重血性羊水的处理以1200 1300 rpm离心10min后,

12、将上清液移入另1无菌离心管中,保留约1ml羊水并混匀,另取1离心管加入约2ml无菌淋巴细胞分离液,再将混匀的羊水细胞悬液12ml缓缓加入淋巴细胞分离液的上层,要求分层清晰,以12001300 rpm离心10 min后,液体分4层:自下而上依次为红细胞、分离液、羊水细胞、羊水。吸取中层薄薄的一层羊水细胞于1离心管中用首次分离出来的羊水上清液洗涤分离出来的羊水细胞23次,以除去混入的细胞分离液,最后留下0. 5ml羊水,轻轻混悬细胞,以备接种用。严重胎粪、胎脂污染的羊水也可用此细胞分离方法提纯羊水细胞。6.羊水细胞培养与制片将羊水细胞用无菌滴管打匀,接种于50ml塑料培养瓶中,并加入changme

13、dium c培养液4m,l用滴管轻轻混匀,盖上瓶盖,切勿拧紧,置于5% co2培养箱中培养。到第5天若观察到有较好的梭形细胞克隆则更换新鲜培养液。将原来的培养液及混悬的羊水细胞转入一个备用的无菌小瓶中,封盖仍放入5% co2培养箱中。收获时在培养终止前4h加入秋水仙素,最终浓度为2. 0mg/ml2. 5mg/ml。羊水细胞的收获、制片、显带等操作同传统的方法。如若收获失败,制片中没有可用于分析的染色体核型,则将备用小瓶中的羊水细胞重新分离接种入细胞培养瓶中并加入新鲜的培养液4m,l后面的步骤同新接种的羊水细胞培养步骤一样。7.污染羊水的处理羊水细胞接种后,前两天每天观察12次,以便观察是否有

14、污染,若无污染,则不再观察,若有污染的证据应立即加入广谱抗生素(如阿莫西林或氨苄西林),浓度为10g/ml15g/m,l加入12h后,观察抗菌效果,如果有抗菌效果则再加入1次抗生素,如果抗菌效果不明显,再加入另一种抗生素(如头孢曲松)15g/ml20g/ml。每24h加入1次,一般不超过3次(抗生素在体外代谢较慢,药物浓度有累加效果),待有细胞贴壁时马上更换新鲜的培养液,并加入10g/ml15g/ml的广谱抗生素。结果1.总共338例羊水标本一次性培养成功率达到99. 4%(2例失败)。325例一般羊水收获时间平均为7. 8d,最早的45中国优生与遗传杂志2007年第15卷第6期在第一次换液(

15、第5天)即可收获,最长的为16d。2. 9例严重血性羊水均培养成功,前3例未经过处理培养周期为1533d,经过细胞提纯处理的后6例羊水培养收获时间为718d,处理后的羊水贴壁时间明显提前。3. 4例微生物污染的羊水1例未作任何处理,培养失败;另3例发现污染后立即加入广谱抗生素, 1例因发现较晚培养失败, 2例培养成功,收获时间分别为13d、18d。4.收获的336例羊水细胞,每例制备68张染色体玻片, 229例可获15个以上可分析的核型;另有7例收获制片后,无法进行核型分析,又将备用瓶中的羊水细胞重新接种,2次或3次培养、收获、制片成功。讨论影响羊水细胞培养成功率的因素很多2, 6,但主要的是

16、培养基的质量和羊水中存活细胞的数量。我们应用了多种品牌的羊水培养基,认为美国irvinescientific公司生产的changmedium c专用羊水培养基效果较好,细胞贴壁时间早,生长快。对1727w的羊水培养情况进行分析后,认为羊水的最佳采集时间为1824w之间。18w之前羊水中细胞比较少,贴壁细胞克隆少,收获较晚; 25w之后的羊水有形成分增多,常较混浊,由于有形成分较多(包括大量的死细胞),严重地影响了活细胞的贴壁,因此也造成收获时间延长。孕周大的羊水一旦发现几个贴壁克隆时就应及时换液,消除大量有形成分对贴壁细胞生长的影响。孕周越大,死细胞越多、杂质越多、活细胞越少,细胞贴壁越困难。

17、羊水收集时机的把握是能否制得良好染色体核型玻片的关键3。细胞克隆多、面积大、透亮细胞多时可收获较多的分裂相。实践中我们观察到:类圆形细胞克隆收获的分裂相最好,梭长形羊水细胞克隆收获时分裂相易受细胞数量的影响。这可能与类圆形细胞贴壁可能不是很紧,易收获、低滲效果好、滴片时细胞易破碎有关而梭长形羊水细胞克隆贴壁紧、不易因低滲肿胀、滴片时细胞不易破裂,因此核型分散效果相对较差。所以要弥补梭长形羊水细胞克隆的这一缺点,就必须要有较多的贴壁细胞和透亮细胞。如果细胞克隆较少且生长的细胞数较少,应及时进行传代3,以便获得较多的细胞克隆,否则一个细胞克隆时间过长细胞生长的速度就会变慢,分裂相对减少。对严重血性

18、羊水来说,由于混入了大量的红细胞,严重的影响了成活羊水细胞的贴壁4,同时羊水中混入的血浆也容易使羊水凝集,常规分离获得的羊水细胞中除混有大量的红细胞外,还混有纤维蛋白丝等,这些成分对细胞的生长也有抑制作用;大量的红细胞不仅严重影响羊水细胞的贴壁而且在羊水培养的过程中红细胞会不断的破坏,释放的血红素对羊水细胞也有一定的毒性作用。我们通过细胞分离技术,提纯羊水细胞,消除了红细胞对羊水细胞贴壁的影响,消除了纤维蛋白及其降解产物对细胞生长的影响,消除了血红素对羊水细胞的毒性作用,使血性羊水的收获时间明显提前。从羊水采集到收获的过程比较复杂漫长,其中的任何一个环节都有可能对羊水或培养物造成污染5, 6,

19、 7,我们在日常工作中一定要严格操作规程,注意无菌操作。同时严密观察,一旦发现有污染现象应及时采取措施,首要的方法是加入抗生素。我们在发现羊水有污染时加入抗生素,及时的挽救了部分污染标本,减少了病人的痛苦,提高了实验技能。由于抗生素在抗菌的同时也会抑制羊水细胞的生长,因此加入抗生素的量和种类一定要合适。我们目前应用的抗生素的量也只是一个探索用量,最佳抗生素用量还有待于进一步探索。解决羊水微生物污染的关键还是严格无菌操作程序。综上所述,采用合格的培养基、备份式的羊水细胞收获、血性羊水的细胞纯化及在污染羊水细胞培养瓶中加入合适的抗生素等可以增加羊水细胞的贴壁几率、缩短羊水细胞培养时间、提高羊水细胞

20、培养的成功率,具有重要的临床意义和实际应用价值。参考文献1周焕庚,夏家辉,张思仲,主编.人类染色体m.北京:科学技术出版社, 1987.2刘晓翌,肖晓素,樊尚荣,等.羊水细胞染色体制备方法的研究j.中国妇产科临床杂志, 2004, 5(4): 296-300.3郑育红,孙筱放,孙小蔓.原瓶传代培养应用于羊水产前诊断中的研究j.中国优生与遗传杂志, 2002, 1(6): 58-59.4许争峰,胡娅莉,朱瑞芳.高效羊水细胞培养技术在产前诊断中的应用j.中华妇产科杂志, 2006, 41(4): 275.5seguin lr, palmercg. variable inf1uencing growth andmorphologyand colonies of cells from human amniotic fluid j. prenat diagn,1983, 3: 110.6turhann0,erenu, seckinnc. second-trimestergenetic amnio cente-sis:5-year experienj.archgy