GC-MS在药学研究中技术与应用

1、气相色谱气相色谱-质谱联用技术质谱联用技术n气相色谱气相色谱 -质谱联用仪质谱联用仪GC-MSn (Gas Chromatography-Mass Spetrum)Agilent6890-5975BAgilent6890-5975B气质联用仪气质联用仪GC-MS概述概述一、一、GC-MS的特点的特点二、二、GC-MS的系统构成的系统构成三、质谱检测器三、质谱检测器MSD的组成的组成四、四、 GC-MS仪的主要信息仪的主要信息五、五、 GC-MS的应用的应用一、一、GC-MS的特点的特点nGCGC的分离特点的分离特点+ +质谱的定性特点质谱的定性特点 （三高）（三高）nGCGC将待测样品进行分离

2、直接导入质谱进行将待测样品进行分离直接导入质谱进行检测检测n质谱检测离子质量，获得化合物的质谱图质谱检测离子质量，获得化合物的质谱图n联用技术可以得到质量、保留时间、强度联用技术可以得到质量、保留时间、强度三维信息三维信息气质联用数据是三维的气质联用数据是三维的125010015020025030011109876Time minutesMass daltons气相色谱气相色谱-质谱联用质谱联用 特点：特点：F要求样品气化后进入质谱仪要求样品气化后进入质谱仪F用电子轰击方式（用电子轰击方式（EIEI）得到的谱图，可与标准谱库对比）得到的谱图，可与标准谱库对比F用毛细管色谱柱分离化合物，分离效率

3、高用毛细管色谱柱分离化合物，分离效率高F操作条件稳定、使用方法成熟操作条件稳定、使用方法成熟F适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物n样品分离、鉴定和定量一次完成n检测限可达10-1210-9gn最成熟的一类联用技术最成熟的一类联用技术n适用于小分子、易挥发、热稳定性好样品分析二、二、GC-MS联用系统的构成联用系统的构成n气相色谱仪气相色谱仪n接口接口n质谱仪（离子源、质量分析器）质谱仪（离子源、质量分析器）n数据处理系统数据处理系统出口出口气相色谱仪气相色谱仪高真空泵高真空泵接口接口色谱工作站软件（电脑）色谱工作站软件（电脑）离子源离子源质量分质量分析

4、器析器机械泵机械泵检测器检测器质谱仪质谱仪色谱单元色谱单元n与与GC基本相同基本相同nGC色谱条件：色谱条件： 色谱柱：毛细管柱色谱柱：毛细管柱 温度：气化室温度、柱温、检测器温度温度：气化室温度、柱温、检测器温度 载气载气？及流量：及流量：1ml/minGC-MS对载气选择的要求对载气选择的要求n必须是必须是化学惰性化学惰性的的n必须必须不干扰质谱图不干扰质谱图n必须必须不干扰总离子流不干扰总离子流的检测的检测n应具有使载气气流中的应具有使载气气流中的样品富集样品富集的某种的某种特性特性 HeGC-MS色谱柱的选择色谱柱的选择n柱效好n惰性好n热稳定性好接口技术中要解决的问题接口技术中要解决

5、的问题n气相色谱仪的大气压工作条件和质谱仪的真空工作条件的联接和匹配。n作用：把气相色谱柱流出物中的载气尽可能多地除去，保留或浓缩待测物，使近似大气压的气流转变成适合离子化装置的粗真空，并协调色谱仪和质谱仪的工作流量。 MS为什么需要真空n提供足够的提供足够的平均自由程平均自由程n提供无碰撞的提供无碰撞的离子轨道离子轨道n减少减少离子离子-分子反应分子反应n减少减少背景干扰背景干扰n延长延长灯丝寿命灯丝寿命n消除消除放电放电n增加增加灵敏度灵敏度传输线、接口传输线、接口 MSD GCn真空度： 10-5Torr 760Torr(常压)n流速： 2ml/min 0.5-15ml/minn传输线的

6、要求：使GC和MS都达到最佳操作条件;保证被测组分可从GC传输到MS无不正常现象 (无灵敏度损失、无二次反应、无峰形改变)常用接口常用接口n直接导入型：将毛细管色谱柱通过一根金属毛细管直直接导入型：将毛细管色谱柱通过一根金属毛细管直接引入质谱仪的离子源。适用于小口径毛细管柱。载接引入质谱仪的离子源。适用于小口径毛细管柱。载气限于氦气或氢气，载气流量在气限于氦气或氢气，载气流量在0.71.0ml/min n开口分流型：气相色谱柱的一段插入接口，其出口正开口分流型：气相色谱柱的一段插入接口，其出口正对着限流毛细管。限流毛细管承受将近对着限流毛细管。限流毛细管承受将近0.1MPa的压的压力，与质谱仪

7、的真空泵相匹配，将色谱柱流出物的一力，与质谱仪的真空泵相匹配，将色谱柱流出物的一部分定量地引入质谱仪的离子源。适合于小径或中径部分定量地引入质谱仪的离子源。适合于小径或中径毛细管柱。毛细管柱。n喷射式分子分离型（浓缩型）：填充柱和毛细管柱均喷射式分子分离型（浓缩型）：填充柱和毛细管柱均适用适用气相色谱检测器n热导检测器TCDn氢火焰离子化检测器FIDn电子捕获检测器ECDn火焰光度检测器FPDn氮磷检测器NPDn质谱检测器质谱检测器MSDGC检测器灵敏度比较检测器灵敏度比较pptrillionppbppmppthousandpercentTCDFIDECDAEDPIDNPD (N)NPD (P

8、)MSD(SIM)(SCAN)FPD (S)IRDELCDELCD(S or N)(X)10-15fg10-12pg10-9ng10-6m mg10-3mg质谱检测器（MSD）n样品被电子流轰击后产生离子n这些离子按它们的质荷比m/z被分离后，测量其质量数和丰度值n此检测器可以通过选择适当的质量而使其专一性好，选择性强。三、质谱检测器的组成三、质谱检测器的组成n离子源：离子源：提供样品能量，使样品分子电离生成气态分子提供样品能量，使样品分子电离生成气态分子离子或准分子离子，分子离子还可进一步裂解，产生各离子或准分子离子，分子离子还可进一步裂解，产生各种碎片离子。种碎片离子。用用 70 ev 7

9、0 ev 电子能量轰击的操作方式被称电子能量轰击的操作方式被称为电子电离为电子电离n质量分析器：质量分析器：将来自离子源的不同质荷比离子（离子的将来自离子源的不同质荷比离子（离子的质量与其所带电荷的比值，质量与其所带电荷的比值，m/z）按空间位置或时间先）按空间位置或时间先后分离开的部件。后分离开的部件。 单重四级杆（单重四级杆（Q Q）、三重四极杆（）、三重四极杆（QQQQQQ、TQTQ）n检测器：检测器：用于接收、检测和记录被分离的离子信号。用于接收、检测和记录被分离的离子信号。 高能打拿极和电子倍增器高能打拿极和电子倍增器进样系统进样系统离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器控制和

10、数据控制和数据处理系统处理系统真空系统真空系统离子源离子源n离子源的作用是将被分析的样品分子电离成带电的离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下，会聚成有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。离子化技术离子化技术nEI（电子轰击离子源电子轰击离子源）EIEI（电子轰击离子化）（电子轰击离子化）V加速电压加速电压试样蒸汽试样蒸汽阴极阴极阳极阳极电子束电子束离子离子xyz电子轰击质谱示意图电子轰击质谱示意图Electron Impact Ionizationn电子轰击电离电子轰击。电子电离n轰击电压50-70eV，有机分子的电离电位一般为7-15eVn可提供丰富的结构信息n有些

11、化合物的分子离子不出现或很弱 EIEI源的特点源的特点化学离子化（化学离子化（CICI）n离子室内的反应气（甲烷等；10-100Pa,样品的103-105倍），受电子（100-240eV）轰击，产生离子，再与试样分离碰撞，产生准分子离子。如甲烷作为化学离子化反应气的电离过程nCH4e CH4+2enCH4+ CH2+H2nCH4+ CH3+HnCH4+CH4 CH5+CH3nCH3+CH4 C2H5+H2n形成质子化分子离子M+H+nMCH5+ M+H+CH4nMC2H5+ M+H+C2H4 四、质量分析器及质量分离原理四、质量分析器及质量分离原理n四极杆质量分析器四极杆质量分析器n三重四极杆

12、质量分析器三重四极杆质量分析器n离子阱质量分析器离子阱质量分析器由四根截面呈双曲面的平行电极所组成，常常为圆柱形电极。离子的质量分离是在电极形成的电极场中完成的。四极电场四极电场由加在电极上的直流电压(U)和与之相叠加的射频电压(V)产生。在X方向电极上施加“UV”电压，而在y方向上施加“-(UV)”电压，而V=V0 cost，为射频频率，电极间的相对距离为2r四极杆质量分析器原理离子源中产生的不同质荷比m/z的离子从Z方向进入四极场，在射频电场的作用下，离子的运动方程为： 离子的“a-q值处于该三角形内时，该离子的振幅是有限的，轨迹是稳定的，可通过四极场到达检测器离子的a-q值处于稳定三角形

13、之外，其振幅随时间增大，其轨迹是不稳定的，这些离子将与电极碰撞消失 n选择适当的a/q值(U/V0值)，使扫描线通过稳定区，则扫描线与稳定区二个交点之间对应的质量范围的离子可以沿Z方向到达检测器，而其他离子以不稳定振荡，与电极撞击而消失。当a/q值变为另一个值时，可使另一离子通过四极场-选择离子监测SIMn全扫描SCAN:保持U/V0值及不变，而改变U和V可以实现质量扫描。在给定的时间内不间断地对设定的质荷比(m/z)范围内的所有离子进行扫描。 n如果提高扫描线的斜率，则可提高质量分辨率，但灵敏度下降。如果降低扫描线的斜率，则将降低分辨率。n如果在极端状态，a0(U0)，四极杆质谱仅在射频方式

14、(RF-only mode)下操作，则所有m/z值的离子均具有稳定轨迹可通过四极区，这可用于串联质谱的碰撞室Q2。 扫描类型：n全扫描(full scan, SCAN)：用于未知化合物的定性分析。nSCAN方式需要设置的参数有：扫描质荷比的起点和终点、CID电压等。扫描参数的选择既要兼顾获得含尽量多的有效分子离子和碎片离子的质谱图，又要兼顾获得好的总离子流图。n选择离子监测(selected ion monitoring，SIM)：用于定量分析，常用于目标化合物的检测和在数量众多的样品中快速筛选目标化合物。n与SCAN方式相比，SIM方式能达到更低的检测限、更快的速度、更好的灵敏度和更短的分析

15、时间，适用于定量分析。但选择SIM方式不利于定性分析。n四极杆质量分析器四极杆质量分析器（quadrupole，Q）M1M2M3检测模式全扫描（Full Scan）选择离子检测（SIM）分辨率：低单四极杆特点单四极杆特点n四极杆质量分析器是四极杆质量分析器是GC-MS联用仪中最通用联用仪中最通用的一种质量分析器的一种质量分析器n有全扫描有全扫描(Scan)和选择离监测和选择离监测(SIM)两种不同两种不同扫描模式扫描模式n扫描速度快扫描速度快,灵敏度高，尤其是灵敏度高，尤其是SIM模式模式n可在较低的真空度下工作可在较低的真空度下工作n分辨率较低，不能提供亚稳离子信息分辨率较低，不能提供亚稳离

16、子信息n结构简单、体积小、自动化程度高结构简单、体积小、自动化程度高三重四极杆质谱仪（三重四极杆质谱仪（QQQ）M+H+Q1质量分析器质量分析器Q3质量分析器质量分析器Q2 碰撞室碰撞室活化室活化室. . .串联质谱串联质谱MS/MS低分辨低分辨QQQ特点特点n离子、母离子、中性丢失三种扫描方式离子、母离子、中性丢失三种扫描方式n母离子找子离子获得碎片离子母离子找子离子获得碎片离子n子离子找母离子获得前体离子子离子找母离子获得前体离子n中性基因相关质量的离子，确定各离子归属，中性基因相关质量的离子，确定各离子归属，研究离子的碎裂途径，用于化合物的结构分析研究离子的碎裂途径，用于化合物的结构分析

17、离子阱质量分析器（离子阱质量分析器（ion trap，IT）离子注入离子注入质量选择推出质量选择推出检测模式检测模式全扫描（全扫描（Full Scan）选择离子检测（选择离子检测（SIM）分辨率：低分辨率：低离子阱质量分析器示意图 由三个电极组成的三维四极场处在端电极中心的小孔是离子进出阱的通道。一定固有频率的射频电压施加于环电极上，在环电极和端电极之间有高频电势差，形成了一个四极场。 RF值是指施加在环电极和两个端电极之间的电压，依靠具不同水平的RF值的四极场，离子阱可以在一个特定的质量范围内俘获并稳定一定数量的离子。 IT原理与四极杆质量分析器相似，离子在离子阱中的运动也有稳定和不稳定两种

18、情况。处于稳定区的离子，运动幅度不大，能长期存储在离子阱中。处于稳定区之外的离子，由于幅度过大，会与环电极或端电极相撞而消亡。 质谱过程 n离子被充入离子阱: 通过降低施加在锥形分离器的排斥电压，让离子束通过来实现的。进入阱内的离子被施加了低于四极振幅的射频场俘获。设置好一定的积累时间，锥形分离器的排斥电压升高，以阻止后续离子进入阱内。累积的离子通过与阱内浴气(He)碰撞而冷却。以确保离子云驻留于阱中心一定的空间范围内。n扫描开始，四极和二级的势场增加，离子按质量增加的顺序通过出口端帽被逐出离子阱。n扫描结束后，四极场降低到零以清除残留在阱内的离子。阱回到初始状态，锥形分离器设置为允许离子进入

19、并累积的初始状态，新的循环开始。 IT特点特点n时间上串联的质量分析器，只需一个离子阱时间上串联的质量分析器，只需一个离子阱质量分析器即可实现多级串联质谱，成本低、质量分析器即可实现多级串联质谱，成本低、价格便宜价格便宜n离子阱质量分析器的灵敏度高，离子损失小离子阱质量分析器的灵敏度高，离子损失小-离子利用率高；离子阱质量分析器的质量离子利用率高；离子阱质量分析器的质量范围大范围大扫描方式扫描方式n可实现二次或多次质谱（可实现二次或多次质谱（MSn）分析）分析n全扫描模式全扫描模式SCAN：主要对未知化合物做定性分主要对未知化合物做定性分析析n选择离子扫描模式选择离子扫描模式SIM：主要应用于

20、目标化合物主要应用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析检测和复杂混合物中杂质的定量分析nSIM较较SCAN有更高的灵敏度，峰型较好，排除有更高的灵敏度，峰型较好，排除干扰，提高信噪比，适合定量分析干扰，提高信噪比，适合定量分析四、GC-MS主要信息n总流子流色谱图总流子流色谱图(TIC，total ion current):样品随样品随载气进入质谱检测器中，在不同时间点得到的离子载气进入质谱检测器中，在不同时间点得到的离子总信号的响应图，称为总离子流图。可用于了解样总信号的响应图，称为总离子流图。可用于了解样品的质谱全貌品的质谱全貌 n质谱图质谱图(MS，mass specturm):

21、一个纯粹化合物经一个纯粹化合物经离子化、裂解形成一系列离子的质荷比与强度的分离子化、裂解形成一系列离子的质荷比与强度的分布图。布图。 n质量色谱图质量色谱图-提取离子流色谱图提取离子流色谱图(extracted ion chromatography)n选择离子监测技术选择离子监测技术(SIM)n谱库检索谱库检索总离子流色谱图甲苯的EI质谱图 质谱峰的类型 n分子离子分子离子(molecular ion, M+)峰峰:分子失去一个电子生成的离子称为分子离子，通常以M+表示，分子离子形成的峰称为分子离子峰。n准分子离子准分子离子(qauasi molecular ion)峰峰：软电离质谱可检测到化

22、合物分子得到或失去某一离子而形成的离子称为准分子离子。如分子通常得到或失去一个氢离子形成的M+H+、M-H-准分子离子，常见的准分子离子还有M+Na+、M+K+等离子质谱峰的类型n同位素离子同位素离子(isotopic ion)峰：峰：含元素的重同位素构成的离子称同位素离子，同位素离子形成的峰称同位素峰，在质谱图中同位素峰出现在相应的分子离子或碎片离子峰的右侧（高质荷比侧），如 M+1+、M+2+峰。n碎片离子（碎片离子（fragment ion）：）：由分子离子或准分子离子继续裂解而生成的产物离子。n多电荷离子、亚稳离子等产生的峰。 提取离子流色谱图提取离子色谱图用途n利用质量色谱图法搜寻目

23、标化合物，以利用质量色谱图法搜寻目标化合物，以快速鉴别化合物类型快速鉴别化合物类型n可以检查色谱峰的纯度可以检查色谱峰的纯度n比总离子流图简洁，消除了背景干扰比总离子流图简洁，消除了背景干扰全扫描（全扫描（SCAN） 主要对未知化合物做定性分析主要对未知化合物做定性分析选择离子检测（选择离子检测（SIM） 主要应用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质主要应用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析的定量分析质谱扫描技术质谱扫描技术选择离子监测（SIM）谱库检索谱库检索-NIST05-NIST05谱图检索注意的问题谱图检索注意的问题n1 1、首先简化和筛选谱图，然后比较，计算、首先简化和筛选谱

24、图，然后比较，计算相似系数，按匹配率排序输出。相似系数，按匹配率排序输出。n2 2、检索结果分析、检索结果分析 相似系数判别相似系数判别-匹配率大于匹配率大于90%90%结果可靠结果可靠性大，小于性大，小于60%60%可靠性较差。可靠性较差。GC-MSGC-MS联用仪器主要性能指标联用仪器主要性能指标一、气相色谱仪的性能指标一、气相色谱仪的性能指标 1 1、进样系统、进样系统 分流分流/ /不分流进样口不分流进样口 2 2、柱系统、柱系统 DB-5MS HP-5MS DB-225MSDB-5MS HP-5MS DB-225MS 3 3、检测系统、检测系统 FID ECD MSFID ECD M

25、S质谱仪的主要性能指标质谱仪的主要性能指标1 1、质量范围、质量范围 1-1200u 1-1200u 2 2、准确度、准确度 质量准确度质量准确度0.1u0.1u，给出整数质量，低分辨。，给出整数质量，低分辨。3 3、分辨率、分辨率 1000-20001000-20004 4、扫描速度、扫描速度 4000-6000u/s4000-6000u/s五、五、GC-MS的操作的操作质谱参数选择离子检测参数定性、定量分析定性、定量分析n定性分析：谱库检索完成定性分析：谱库检索完成n定量分析：与定量分析：与GC相同相同定性分析定性分析荆芥油样品荆芥油样品谱库检索分析谱库检索分析定性分析定性分析黄酒样品黄酒

26、样品谱库检索分析谱库检索分析定量分析定量分析样品样品定量分析定量分析对照品对照品对样品的要求对样品的要求1 1、沸点范围宽、化合物性质差别大的样品，、沸点范围宽、化合物性质差别大的样品，需要进行预处理。尤其是石油类样品。需要进行预处理。尤其是石油类样品。2 2、难挥发、热不稳定、有极性基团的化合、难挥发、热不稳定、有极性基团的化合物需要衍生化处理。有机酸类物质。物需要衍生化处理。有机酸类物质。3 3、缺少样品信息，若有条件最好先用气相、缺少样品信息，若有条件最好先用气相色谱分析。色谱分析。4 4、样品进样前需要高速离心，取上层清液、样品进样前需要高速离心，取上层清液进样。进样。六、六、GC-M

27、SGC-MS的应用的应用 1 1、石油中烃类、非烃类单体化合物分析、石油中烃类、非烃类单体化合物分析 2 2、化工原料组成分析、化工原料组成分析 3 3、酒类产品中醇、醛、酸、酯类化合物分析、酒类产品中醇、醛、酸、酯类化合物分析 4 4、香精香料分析、香精香料分析 5 5、烟草成分分析、烟草成分分析 6 6、药物分析：常用于挥发油成分的鉴别、甾体药物、药物分析：常用于挥发油成分的鉴别、甾体药物的分析、中药材中农药残留监测、药物代谢的研究的分析、中药材中农药残留监测、药物代谢的研究等方面等方面 7 7、环境分析：有机污染物等、环境分析：有机污染物等在定性鉴别的应用 n在药物定性鉴别中，GC-MS

28、主要用于药物中杂质的鉴别、药物合成反应历程监控、运动员体内兴奋剂检测、药物的体内代谢物的鉴别等方面，但GC-MS法对样品的极性、挥发性和热稳定性有一定的要求。n在中药定性分析中，GC-MS主要用于中药挥发性成分的定性分析、中药材和中药制剂中残留有机溶剂的定性等。巴豆油化学成分的 GC- MS 分析n巴豆油的甲酯化巴豆油的甲酯化 称取巴豆油样加入 0.5mol /L KOH- CH3OH 溶液 60 水浴皂化 40min(油珠完全消失) ，冷却后加水摇匀，移至分液漏斗，以每次20 mL 乙醚萃取3 次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥，回收乙醚得样品n巴豆油甲酯化或用乙醚稀释后经气相色谱石英毛细管柱

29、分离， 质谱仪记录质谱图，得到 GC- MS 总离子流图GC-MS条件n色谱条件: 色谱柱为 DB- FFAP ( 30 m 0. 25 mm 0. 25 m) 毛细管柱，柱温100 ，以10 /min 程序升温至220 ，保持18 min 进样口温度250 ，载气 He，柱前压 75 kPa，分流比 10 1，进样量0. 5 Ln质谱条件: EI 离子源，电子能量 70 eV，扫描范围 m/ z 29 450 amu，四极杆温度150 ，离子源温度230 ，电子倍增器电压 1 500 V， GC- MS 接口温度280 ， 标准质谱图库 Wiley 275. L巴豆油甲酯化的TIC鉴定出的1

30、6 种脂肪酸成分中亚油酸最高， 相对含量占44.36%。其次是油酸( 18.48%) 、 二十碳一烯酸( 14.49 )SPME/GC-MS 鉴别地沟油新方法n采用固相微萃取( SPME) 气相色- 质谱联用( GC-MS) 技术，研究油脂内源及外源物质的微量化学成分n纯正花生油和大豆油不含反式脂肪酸，地沟油含有反式脂肪酸 trans- C18:1 、trans-C18:2;n纯正花生油和大豆油中含有正己醛、正壬醛和正癸醛等杂质，而地沟油中除了这几种醛类外，还含有乙酸、 3-丁烯腈、 2，5-二甲基吡嗪等特征杂质成分n通过测定内源性物质和外源性物质的存在，两种检测结果互相印证，综合判断，最终可

31、确定是否为地沟油固相微萃取(SPME)n将10. 0 g 地沟油装入20 mL 带有聚四氟乙烯密封塞的顶空瓶中，密封，将带有NACC 专用萃取头的固相微萃取针穿过密封塞插入顶空瓶中，推出 NACC 萃取头( 萃取头距样品表面约1 cm) ，于室温下萃取30 min 后，取出固相微萃取针迅速插入气相色谱进样口中，在240 下解吸10 min，GC MS 测定微量杂质成分甲酯化衍生化n按文献方法将脂肪甘油酯转化为脂肪酸甲酯：称取约0.1 g 脂肪，置于10 mL 量瓶中，加入1 mL 乙醚 正己烷( 1 1，体积比) ，摇匀，然后加入 1 mL 无水甲醇，摇匀，再加入1 mL 0. 8 mol /

32、L KOH -甲醇溶液，摇动 5min，加水至刻度，静置分层，取上层液进行GC-MS测定反式脂肪酸GC-MS 分析nGC条件1(用于 SPME 测定) n色谱柱: AB- 5MS( 30 m 0. 25 mm 0. 25 m) 弹性石英毛细管柱; n载气: He( 99. 999%) ; 恒流，n柱流量: 0. 7 mL /min; n分流进样，分流比: 10 1; 进样量: 1. 0L; n进样口温度: 240 ; n柱始温140 ，保留2 min，以8 /min 程序升温至280 nGC 条件2(用于脂肪酸测定) 色谱柱: HP- 88( 100 m 0. 25 mm 0. 2 m) 弹性石英毛细管柱 柱温170 ，恒温2 min，