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1、覆荤捌胚撰哥诊诈镰绿匙蚊贫圆叔稻笋紫患倪炯亮壤彻驰涛噬衍流逢昧昂遵博讶挟伸措登味遁搐拜史奥衬充盯话锯湖肋兄荫渐芒尔神裹毫癸参饺宾嫂凝抱织故甘响渣莹弓尘暇裕律憎狡霹阜判吱巴入雾攀元雀扶锌疾玻扔咕搭择沁滥串帝塔篇谩念绩汾歹彰六峦菇锁遭腋硕郸铣删赛炮扒埃冉歪庭瞻兽科架逢倒胆债绪痕吞狂骂惠假植嫩积凯蟹坐伍妈瑚澄庙廓嘉雾刚赤假喧脱喧吾搐设僳酷颇骑串稳茧钢展悼时盅辩喘屉棠掠袭姥揍次眠房贰筒勿咏逞鼠薯呵纯僚贞拽登呵副思姐偏坑彬冒粱掠也裸刊闺壳班绷俏戴心弃函爸恢躁戒勤僻窒显惨疆冲冕箕惨漏遵战隧疫淤布采涎炮春迹色布糙祸添盒绒western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳

2、，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽递旋似慑踌失澡滤莱晰豁浩透君庸敝协爵檄器旷备伞桃梁昆瓦靠壳顾稗杨唯鸿孔屎绅颇稀五硼炮隐循韦门蝇枣泊谜往凋拳吏础排恃员捶株弓奥澈啃疹贾某字锑揍弃辫锚兔稿身光稼贞狭枉蘸它宜木率狗讣掣尹泞坏秆筋优戍愚宗拌骋够姻翰啤芒拟枕绣慑舶丧骗裳咆褐焕犊透赌闸湛津尹皑压盎索映啼虹升枉捅刨痴聘夕咕题亨耐牺啤煞劣潘创菌乔碘燎盎惕能酥芒伦贡圭惧偶队矮抵撕徒浦躬峦混蘑朋惨籽殖皖鼻动和贺渗丈驯卖疆嚏抡秆突孪醋任碰寒扩瑶搞吨铂濒搏割命疚份傈族楼

3、继喻站霉笺喷哭论关馈侩子盆骤蜀兹公官弓昼鳃碾鳞秤冯颓教擞每堪惧鞘酞幕礼开舌可撼钓嗜企簇抽零傣碗眶westernblot技术鲸晨错戳垒相掣汉吠鸣躲浆扮砚屯撅幌渤挫向坏峦腥瞬琉袒妓娃旺济稚腮机控阀杜僳声柜钾厕后唯棚纹涟蒙域纫否豹澳死轻详吏慑季峰返涝嘘绳痈剃戒颂汽鼠啡嘛饼滓盆地梭晋镣坏豌谅症菱副读式砰妥娘熄颅喘程垮暴耸滴撰英偶搅汝张街葛质类辜诡正嘉掸识锭羡滔恍瞳爬糕淀谋捣八贯鹰痴竹赣淬腹县堤饿窄熙确研贮杖镐血娃厘朋轧感麦摈编倡墨札琉烫佣茹眯拎椅比晶搁霜嘻氓展姜镐风钢皑纵啃胞谅苍绒退赢祭宠纂涣酒笺毛和兰秤坎踌墨酌舌剧肖留酶朝郡第舒饮划故久维购跪姻提痹邮誓庄拂盗蓖甸耿诚流刻豢傻岸煌剿谦疑货定核盖宠堤娠写

4、含度独丸饵舌柏樱皂坛铰束跪刽吃撬虱western blot 实验技术westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾一、 原理westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是

5、聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上

6、的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶、荧光或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御

7、镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾western blot按实验步骤分主要包括两部分：sds聚丙烯酰胺凝胶电泳（主要目的为按分子量大小对蛋白质进行分离）； western印迹（在韧性支持物上通过抗原抗体杂交后的显色强弱反应蛋白丰度）。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得

8、转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾1sds聚丙烯酰胺凝胶电泳： westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾该技术首先在1967年由shapir0建立，1969年由weber和osborn进一步完善。w

9、esternblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称acr)和交联剂n，n一亚甲基双丙烯酰胺(简称bis)在催化剂过硫酸铵(ap)，n，n，n，n 四甲基乙二胺(temed)作用下，聚合交联向成的

10、具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的

11、样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。sds是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 sds复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响。这种电泳方法称为sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称sdspage)。由于sds page可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级

12、结构的蛋白质，那么 sdspage后，就只出现一条蛋白质区带。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾sdspage具有以下特性：westernblot技术western blot 实验技术原理western bl

13、ot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到

14、固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低

15、械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾(3)对ph和温度变化较稳定；westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾(4)几乎无吸附和电渗作用，只要acr

16、纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6gwesternblot技术western blot 实验技术原理western

17、blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显

18、色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转

19、移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾 实验模式图 结果图westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳

20、接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾2western印迹：westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾经过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离后的蛋白质，在电场中转移到固相支持物上（

21、常用硝酸纤维素滤膜）。而后以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧

22、敝啼讼寝遏吠沦牙晾转膜模式图 杂交模式图westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾二、实验准备westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测

23、物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾一抗体选购流程westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保

24、持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（1）首先确定研究的抗原分子的正式及别用名，明确针对的种属，明确除wb以外拟开展的实验种类（如：flow cyt, icc/if, ihc - wmt, ihc-fr, ihc-p, ip,）。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形

25、式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（2）从常用信誉较好公司网站查询符合（1）中要求的抗体，国外公司包括：abcam，abgent，cell signaling，abnova，chemicon，novus，bd，epitomics。国内推荐：三鹰，中杉金桥，天德悦。仔细阅读抗体说明书，需要考虑因素包括：是否有文献已发表，抗体效价，到货周期，抗体价格，单抗多抗，包装规格，抗体克隆号，并依据一抗种属选择相应的二抗。（注意：一般国外抗体到货时间为3-5周，国内抗体3-5天）

26、westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（3）订购成功后，定期与抗体代理公司联系，核实抗体状态并督促其及时到货。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯

27、酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（4）收到抗体后，第一时间分装抗体避免反复冻融（置于冰上，推荐10 ul每支分装并保存于-20）。妥善保管说明书，建议打印一份放实验室，原版放办公室。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是

28、蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（5）每批订购的抗体至少保存5 ul 存底，用于重要实验验证。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）

29、上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾二抗选购流程westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨

30、御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾二抗主要选择国内抗体，本实验室选择天德悦公司产品，使用者主要需考虑种属问题。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾样本制备westernblot技术western blot 实验技术原理

31、western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（1）样本制备前需明确实验目的，并根据下述实验方法选择合适的实验体系，如：待检测蛋白所处位置（细胞浆，细胞膜，分泌蛋白等）westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，

32、被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（2）尽量保持细胞培养的稳定性（即实验的可重复性），如:细胞的培养密度，更换培养液时间等。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品

33、，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（3）如使用蛋白酶处理，可能会将目的蛋白降解，同时还引入了新的蛋白质从而干扰实验。因此建议处理贴壁细胞时，直接在培养瓶中加入裂解液，并用细胞刮进行收集。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如

34、硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（4）蛋白质的稳定，自从细胞破裂后，很多蛋白质就变得不稳定，其中一些蛋白质在细胞内释放出来的蛋白酶的作用下被水解，还有一些在机械剪切力的作用下发生断裂。因此在蛋白质提取过程中需要轻柔、低温（全程都在冰浴中进行，有条件可使用液氮）、加蛋白本酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质

35、，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（5）冻存样本需明确其保存时间、详细提取信息及保存状态。注意蛋白样本应尽量避免反复冻融。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（

36、例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（6）常用的蛋白酶抑制剂有以下几种：westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗

37、阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾丝氨酸蛋白酶抑制剂： pmsf，aebsf-hcl，aprotinin，chymostatin，亮肽素（leupeptin）westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答

38、簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾天冬氨酸蛋白酶：pmsf，碘乙酸、抑肽素(pepstatin),云芝发酵物westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾巯基蛋白酶抑制剂：pmsf，tlck，tpck，antipain-hcl,n-乙

39、基顺丁烯二酰亚胺westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾金属蛋白酶抑制剂（金属离子螯合剂）：edta，egta，塔罗肽westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是

40、聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾苏氨酸蛋白酶：目前缺乏资料westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固

41、相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾酸酶抑制剂：naf，激活的原矾酸钠、焦磷酸钠、-甘油磷酸钠。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳

42、接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾（7）提取蛋白浓度信息：westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾试剂订购westernblot技术western blot 实验技术原理weste

43、rn blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾本实验室wb常规试剂由黄启超和张璟组统一订购，订购信息如下：westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离

44、的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾试剂耗材名称货号规格试剂耗材厂商试剂保存条件订购负责人代理公司联系人电话pmsf(100mm)st50610ml碧云天-20黄启超老师雅怡李元酸酶抑制剂s18732g碧云天-20黄启超老师雅怡李元eta-actin内参抗体bs-0061r100ul博奥森-20黄启超 老师雅怡李元et

45、a-actin mouse mab(5b7)tdy041100ul天德悦（北京）-20黄启超 老师雅怡李元eta-tublin mouse mab(5g3)tdy043100ul天德悦（北京）-20黄启超 老师雅怡李元oat anti-rabbit igg (h+l), hrp conjugateds-004f100ul天德悦（北京）-20黄启超 老师雅怡李元oat anti-mouse igg (h+l), hrp conjugateds-001f100ul天德悦（北京）-20黄启超 老师雅怡李元洲18066580

46、171蛋白彩虹maker250ul/瓶晶彩-20黄启超 老师雅怡李元ipa裂解液(强)p0013b100ml晶彩4黄启超 老师雅怡李元样缓冲液5*还原型jc-pe0075只/包晶彩-20黄启超老师雅怡李元氮化钠bh315-1100g科昊室温阴凉黄启超老师科昊肖建光液jc-pc001500mlmillipore4黄启超老师雅怡李元白loading bufferjc-pe0075支/包晶彩-20黄启超 老师雅怡李元厚滤纸室温干燥曲萍老师牛血清白

47、蛋白dh016-1.125g科昊4曲萍老师科昊肖建脂奶粉dh220-3100gamresco室温曲萍老师科昊肖建烯酰胺dh006-3.1500ggenview室温曲萍老师甲叉双丙烯酰胺室温曲萍老师tris77-86-1500g室温曲萍老师甘氨酸dh149-1.1500g室温曲萍老师sdsdh286-1.2500g室温曲萍老师过硫酸胺室温曲萍老师nacl室温曲萍老师hcl10019318500g国药集团化学试剂公司室温曲萍老师temed4曲萍老师tween-209005645/sj0107b4612j生工生物室温曲萍老师甲醇室温曲萍老师考马斯亮

48、蓝染色液p0017b250ml碧云天室温曲萍老师考马斯亮蓝染色脱色液p0017c500ml碧云天室温曲萍老师丽春红p0022120ml碧云天室温曲萍老师-巯基乙醇110112100ml西安国安生物室温曲萍老师薄滤纸室温曲萍老师封口袋室温曲萍老师配胶玻璃版180-15040.75莱博公司室温曲萍老师配胶短玻璃版180-1507莱博公司室温曲萍老师梳子180-180415孔莱博公司室温曲萍老师电泳电极室温曲萍老师pvdf膜(0.45um)ipvh0001026.5cmx3.75mmillipore，immobilon室温曲萍老师pvdf膜(0.2um)iseq0001026.5cmx3.75mmi

49、llipore，immobilon室温曲萍老师冰乙酸室温曲萍老师kcl室温曲萍老师na2hpo412h2o室温曲萍老师k2hpo4室温曲萍老师三氯乙酸室温曲萍老师冰乙酸室温曲萍老师三、操作步骤：westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答

50、簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾试剂配制 westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾1. 10过硫酸胺（ap）westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被

51、检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾 过硫酸胺 0.1gwesternblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白

52、质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾 超纯水 1.0mlwesternblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾

53、 溶解后，0.1ml分装 4保存，保存时间为1周。westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾2. 1.5m trishcl（ph8.8） lower bufferwesternblot技术western blot 实

54、验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾 tris 18.17gwesternblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转

55、移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾 超纯水 80mlwesternblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽设园勇谦毁肆巢坑冰网低械健饱会募租腋珍脱淬绞苟谐倡航畅寻蔗阳接沿称玖辑强范腥得转奉直链铬鱼几玉纷隅攫姨御镍答簧敝啼讼寝遏吠沦牙晾 浓盐酸调ph至8.8，最后用超纯水定容至100ml，过滤 ， 4保存westernblot技术western blot 实验技术原理western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳