肠道菌群与高脂血症相关性研究

1、肠道菌群与高脂血症相关性研究研究目的收集 2021年 1月-10 月中央民族大学校医院慢性病体检人员的临 床生化检测信息和粪便生物样本 , 采用二代测序技术检测粪便样本中肠道菌群 ASV( arnplicon sequence variant)的丰度 , 通过倾向性评分匹配法控制性别、年龄、高血压、糖尿病等混杂因素的影响 , 筛选出高脂血症与非高脂血症人群的 差异ASV,再利用WGCNft概率图模型(贝叶斯网络)模拟差异 ASV与高脂血症 的因果作用关系 , 为核心菌群预防与治疗高脂血症提供科学依据。研究方法菌群 测序与结构分析提取各粪便样本肠道菌群总 DNA根据细菌V3-V4区设计引物(上

2、游弓I物为5 -ACTCCTACGGGAGGCAGCA下游弓I物为5 -GGACTACHVGGGTWTCTAAT扩增 16S rRNA基因，在 illumina Hiseq2500 平台 上进行高通量测序,生成FASTQ格式的下机数据。运用R软件DADA2包过滤，去重复，嵌合体识别和合并双端读取，完成物种注 释;用R软件vegan包分析a多样性、B多样性,初步探索两组样品间的菌群结构 差异。差异筛选与富集分析为了控制混杂因素对实验结果的影响，运用R软件 MatchIT 包按 1:1 的比例将高脂血症组与非高脂血症组进行倾向性评分匹配。再利用R软件DESe包筛选倾向性评分匹配后的高脂血症组与非高

3、脂血症组 的差异ASV按照界、门、纲、目、科、属、种的分类结构绘制差异ASV勺分类树,并对每个分类进行富集分析。功能聚类与因果模拟运行R语言WGCN包进行差异ASV的共表达分析,寻找差异ASV功能聚类模块与高脂血症及其生化指标(CHOTG HDL-C LDL-C)的关系；对与高脂血症临床指标有显著性关联的功能 模块中差异ASVS行贝叶斯网络分析,推测高脂血症与ASM相互作用关系,确定 高脂血症核心菌群研究结果本研究共收集 133 例体检人员的临床生化信息和粪便生物样本。 其 中,高脂血症样本 87 例, 非高脂血症样本 46例。菌群测序与结构分析通过dada2包对数据前处理,生成20295个A

4、SV 87份 非高脂血症粪便样品 , 在门水平上共 23 个, 含量最高的四个细菌门依次是 Bacteroidetes (46.7%)、Firmicute ( 44.2%)、Actinobacteria (8.0%)和 Proteobacteria (0.3%); 在属水平上 , 共有 368个属, 有 18 个相对丰度大于 1.0% 细菌属。相对丰度>5%属,依次为 Bacteroides (33.32%)、Prevotella9 (7.68%)、 Bifidobacterium(6.74%)、 Faecalibacteriu(5.77%)。在相对丰度大于 1.0%的细菌属中 , 属于

5、拟杆菌门有 Bacteroides 、 Prevotella9; 属于放线菌门为 Bifidobacterium; 属于厚壁菌门有 Lachnospira (3.64%)、 Agathobacter (3.46%)、 Lachnoclostridium(3.39%)、 Blautia (1.93%)等。46份非高脂血症粪便样品 , 在门水平上共 19个, 含量最高的四个细菌门依次 是 Firmicute (50.67%)、 Bacteroidetes (42.88%)、 Actinobacteria ( 5.84%) 和 Verrucomicrobia (0.26%)。在属水平上共有 297个

6、属, 有 18 个相对丰度大于 1.0%细菌属。相对丰度>5%属，依次为 Bacteroides (33.75%)、Faecalibacteriu (9.40%)、 Prevotella 9(5.23%)。在相对丰度大于 1.0%的细菌属中 , 属于拟杆 菌门的有 Bacterokides (33.75%)、 Prevotell9 (5.23%)、 Alistipes(1.51%)、Parabacteroide ( 1.17%) ; 属于放线菌门为 Bifidobacterium ( 4.77%) ; 属于厚 壁菌门的有 Lachnospira (3.54%)、 Agathobacter

7、 (3.77%)、 Lachnoclostridium2.78%)、 Blautia (1.665)、 Lachnoclostridium(9.40%)等。高脂血症组与非高脂血症组 Alpha 多样性( Chao1 p=0.64,Observed species p=0.75,Simpsonp=0.6,Shannon p=0.71 )、Beta 多样性( Bray-Curtis distance (R2=0.007,p=0.52 ),jaccard distance(R2=0.07,p=0.48 )均没有显著性差异(p>0.05 )。差异筛选与富集分析采用 PSM法 (匹容差为0.2 )

8、将高脂血症 组与非高脂血症组按 1:1 的比例配对 , 共匹配出 44 对。匹配后的人群根本特征除了暴露因素(CHO TG HDL LDL)有显著性差异, 混杂因素(年龄、性别、其他疾病等)均无显著性差异。随后利用R软件的DESeq 包, 筛选倾向性评分匹配后的高脂血症组与非高脂血症组的差异ASV。共筛选出 359 个差异 ASV(|logFC|>2 且 adj.P.Val<0.01)。与 ASV物种注释表比对,差异ASV在门水平上被分为拟杆菌门(Bacteroidetes )、厚壁 菌门(Firmicutes )、变形菌门(Proteobacteria )、梭杆菌门(Fusoba

9、cteria )、 放线菌门( Actinobacteria )、疣微菌门( Verrucomicrobia ) , 共 6 个菌门。在属水平上被分为拟杆菌属( Bacteroides )、RuminococcaceaeUCG-01 、4 Paraprevotella 、 Asteroleplasma 、 Prevotella9 等,共42个属,其中有35个ASV只能注释到科水平。分 类学上 , 高脂血症与非高脂血症的关键菌群为拟杆菌属、Prevotella9 、 Parabacteroid9 、 Paraprevotella, 同时 这些群落都隶属于拟杆菌科至拟杆菌门的脉络上。功能聚类与因果

10、模拟通过对 88 个样本的高脂血症检测指标及该疾病与各个 模块进行关联分析 , 筛选出与临床信息显著相关的目的模块。根据加权基因共表 达网络与高脂血症临床信息关联结果显示:CHO并没有与之相关的模块,与TG显 著正相关的模块为 blue 模块(cor=0.22,p=0.44 )、red 模块(cor=0.26,p=0.01 ),其中模块所包含的ASV隶属于厚壁菌门和拟杆菌门，主要菌属有拟杆菌属、毛螺 菌科、Erysipelatoclostridium 等；与HDL-C显著负相关的模块为cyan模块(cor=-0.25,p=0.02 ),模块内ASV隶属于拟杆菌门且皆为拟杆菌属；与LDL-C 显

11、著负相关的模块为magenta模块(cor=-0.23,p=0.03 ),ASV隶属于厚壁菌门 和放线菌门 , 共有 3 个属 , 分别为双歧杆菌、 Ruminococcus2、Rothia;salmon 模块(cor=-0.22,p=0.04 )、pink 模块(cor=0.23,p=0.03 )、green 模块(cor=0.26,p=0.02 )与高脂血症(HL)显著相关，但是salmon模块与HL 是显著负相关,pink模块、green模块HL是显著正相关。其中与HL显著负相关salmon模块的ASV的Prevotella9 隶属于拟杆菌门。HL显著正相关pink、green模块的AS

12、V隶属于拟杆菌门、厚壁菌 门,以拟杆菌属和毛螺菌科为主。在差异功能模块中,根据贝叶斯网络分析,ASV151直接影响HDL-C该菌为拟杆菌门的拟杆菌属(Bacteroides )。ASV1756直接影响LDL-C,该菌为双歧杆菌( Bifidobaoterium )。ASV360直接影响高脂血症，且高脂血症呈负相关，该菌为拟杆菌门的Prevotella9 。ASV428 ASV658直接影响高脂血症,且与高脂血症呈 正相关 , 该菌为拟杆菌属( Bacteroides )。研究结论从分类学角度，ASV151、ASV360 ASV428 ASV658属于拟杆菌门,ASV1756属于放线菌门；ASV151、ASV428 ASV65