血液血管干细胞

1、造血和血管共同的祖细胞-血液血管干细胞自从1998年第一次从内细胞团分离到人的胚胎干细胞，基于早期的小鼠胚胎干细胞可以分化为几乎所有三个胚层的细胞的研究，胚胎干细胞的全能性使人们很快认识到胚胎干细胞在再生医学中的潜在应用价值。人们相信干细胞的研究将带来临床治疗各种疾病的革命，如心血管疾病、神经退行性疾病，糖尿病及癌症等。但是，由于存在伦理上的问题，人们开始将方向转为从成体寻找并研究干细胞。目前对成体干细胞的研究和应用取得了可喜的成果，组织器官的成体干细胞不仅对其所在的组织器官有重建和修复功能，而且还能分化为其他组织器官的细胞，我们实验室在成体干细胞可塑性方面也做了许多有意义的工作。因此，对成体

2、干细胞的深入研究必将对再生医学提供了巨大的应用价值。干细胞的概念干细胞被认为是具有自我更新、多向分化潜能和增殖特性的细胞。从受精卵开始进行了两次分裂后的细胞具有全能性（totipotent），可以形成胚胎和胎盘的滋养层细胞。随后，逐渐发育成的内细胞团，可以分化为几乎来自三个胚层的所有细胞，被认为是多系分化潜能的干细胞（pluripotent stem cells）,但不能形成胚胎，因为其不能形成胎盘和支持组织。而胚胎干细胞即被认为具有多系分化潜能的干细胞。大部分组织器官的干细胞是多能干细胞（multipotential stem cells），其可以分化为本组织固有的细胞系。大部分组织器官的干

3、细胞是多能干细胞（multipotential stem cells），其可以分化为本组织固有的细胞系。如小肠干细胞可以分化为小肠所有四种细胞。而神经干细胞可以分化为三种神经细胞被定义为tripotential stem cells。有双向分化潜能的干细胞称为bipotential stem cells, 如血液血管干细胞（hemangioblast）。细胞只产生一种特异的细胞的干细胞被称为unipotential stem cells, 如表皮干细胞和肝脏干细胞，分别只产生角化的鳞状上皮细胞和肝细胞，虽然对此存在争议，有人称这种特性的细胞为定向的祖细胞(committed progenito

4、rs)，但此类细胞的确具有较大的克隆潜能，也仍被认为是干细胞(1)。以下主要介绍胚胎和成体内的双向分化潜能的干细胞血液血管干细胞。胚胎发育过程中的血液血管干细胞内皮细胞是胚胎发育中最早出现的细胞，内皮和造血细胞都起源于中胚层。在一百多年前，人们就假内皮细胞和造血细胞可能起源于共同的祖细胞。现在，已经普遍接受把造血和内皮细胞起源于共同的祖细胞定义为血液血管干细胞（Hemangioblast）。这主要由于在胚胎内外不同位点造血细胞和内皮细胞的发育密切相关。在胚胎发育过程中，中胚层细胞迁移到卵黄囊并形成细胞聚集，即血液血管干细胞簇，继而内皮细胞和造血细胞同时产生，从而导致血岛（blood islan

5、d）的发育，内皮细胞在外，而造血细胞在内，在每个血岛相互融合形成第一个胚胎外的血管网(2,3)。卵黄囊内发育的造血细胞是大的有核的原始的红系祖细胞。在形成原始红系祖细胞后的1天，也检测到具有多系潜能的造血祖细胞的特征，提示卵黄囊的血岛有造血干细胞(HSC)特征。但是在胎肝造血形成之前，没有明确的造血细胞分化发生(4,5)。卵黄囊起源的HSC是不成熟的HSC, 当将卵黄囊的细胞注射到放射线照射的成体受者，不能显示成体重建造血的能力(6)。而约9天的卵黄囊含有的造血细胞却能使放射线照射的新生受者重建造血。说明在其他部位还存在造血干细胞起源（7）。目前的研究表明在胚胎内，HSC起源的最早位点在P-S

6、p/AGM区（para-aortic-splanchnopleure/ aorta-gonad-mesonephros主动脉旁脏壁层/主动脉性腺中肾区）。E8天的胚胎P-Sp区最早形成的组织是成对的背主动脉(8)，E9天融合为一条背主动脉并通过卵黄动脉与卵黄囊的血管网连接，脐动脉将背主动脉和胎盘连接（9）。而当分离的E8.5-9天的胚胎P-Sp/AGM 移植到免疫缺陷SCID鼠可以检测到IgM 和B细胞，体外培养P-Sp/AGM区可以产生粒系和淋巴系细胞。最后，P-Pp/AGM区含有CFU-S(spleen colony formation cells)，来自E10的胚胎AGM区含有长期重建的

7、HSC (10)。进一步研究表明在AGM区的主动脉检测到成体长期重建的造血干细胞(11)。来自鸡、小鼠和人胚胎背主动脉的腹侧壁都检测到造血细胞簇（12）。而胚胎发育的后期，一些主要动脉像卵黄动脉、脐动脉都与造血细胞的产生有关，HSC被认为是从这些血管的内皮细胞产生出来的。Jaffredo (13)研究显示在鸡胚背主动脉CD45+VEGFR-2(Flk1-或KDR)的造血细胞似乎从VEGFR-2+(Flk1+)的内皮细胞发育而来，同样Nishikawa(14)研究证明来自小鼠胚胎9.5天的卵黄囊的VE-cadherin+/CD45-/Ter119-（内皮细胞表型）的细胞，可以产生包括淋巴细胞在内

8、的造血细胞，说明在胚胎内，血管和造血细胞的发育是密切相关的，内皮和造血细胞起源于共同的祖细胞-血液血管干细胞。以上研究表明，胚胎外的卵黄囊和胚胎内P-Sp/AGM区都是造血细胞的最早的起源位点，并且与血管细胞密切相关，说明在胚胎发育的过程中这两个位点是血液血管干细胞存留部位。支持血液血管干细胞存在的证据也包括造血和内皮细胞系表达相同的基因。例如，表达在内皮细胞的VEGF(血管内皮生长因子)受体，即酪氨酸激酶受体flk1, tie-1, tie-2也表达在早期的造血祖细胞（15）。转录因子scl (stem cell leukemia gene)也同时表达在造血和内皮细胞(16)。CD34被用来

9、鉴定造血祖细胞的表型，也表达在内皮细胞上（17）。另外，AGM区高表达糖基化蛋白PCLP-1(podocalyxin-like protein1)的细胞可以生成造血和内皮细胞(18)。而斑马鱼cloche基因突变后不能产生内皮和造血细胞。以上研究提示存在内皮和造血的共同组细胞(19)。尽管在胚胎发育过程中存在血液血管干细胞，但是分离、鉴定和研究胚胎来源的血液血管干细胞还存在诸多困难：胚胎发育在这阶段是非常快的，获得血液血管干细胞存在位点的组织非常困难，并且能够得到的细胞也非常少。然而，最近体外胚胎干细胞的研究进展，为血液血管干细胞的研究提供了体外模型。EC在体外可以分化产生为立体的、分化的细胞

10、团称为是胚胎小体EBs (embryoid bodies), EBs在体外可以分化为多种细胞系包括神经、肌肉、内皮和造血细胞。在EBs发育的内皮和造血细胞的过程模仿了卵黄囊的血岛发育过程。来自EC的EBs体外分化为BL-CFC（blast colony-forming cell）,BL-CFC接种在半固体培养基如甲基纤维素并在VEGF的作用下形成blast colonies，基因鉴定这些blast colonies的细胞表达CD34,scl和flk1。进一步将blast colonies细胞重新接种在内皮和造血细胞的培养环境中，可以形成原始的内皮和造血祖细胞，非常重要的是，来自blast co

11、lonies的内皮和造血祖细胞是克隆源性的。以上研究表明BL-CFCs代表血液血管干细胞(20)。 影响血液血管干细胞发育的关键分子1. Flk1在血管和造血发育过程中，VEGF受体Flk1起到非产常重要的作用。而在胚胎发育过程中Flk1是血液血管干细胞发育所必需的。Flk1 是侧板中胚层和卵黄囊最早分化的内皮细胞和造血细胞的标记，在功能上Flk1是血液血管干细胞产生所必需的(21,3,22)。 Flk1基因缺陷小鼠，由于卵黄囊不能形成血岛，造成缺乏成熟的内皮细胞和造血细胞而使8.5-9.5dpc(days post-coitum)胚胎死于子宫(3)。 嵌合研究表明flk1-/-的ES细胞体内

12、不能参与形成血管，也不参与原始的和成熟的造血发育(23)。前面介绍VEGF使BL-CFC形成blast colonies细胞子代flk1基因表达，进一步从EBs细胞群体中分离的Flk1+的细胞重新接种，在VEGF作用下形成blast colonies, 而Flk1-的细胞却不能形成，说明血液血管干细胞表达Flk1。此结果与从鸡中胚层分离到的Flk1+细胞分化为内皮和造血细胞相一致（22）。尽管flk1缺陷小鼠和flk1-/-与野生型的嵌和小鼠证明在卵黄囊的血岛和胚胎的发育中，Flk1是内皮细胞和造血细胞发育所必需的。但是VEGF和Flk1相互作用似乎并不是内皮和造血细胞发育所必需。VEGF+/

13、- 和flk1-/-小鼠仍残留有造血和内皮的活性（24,25）。在体外，flk1-/-缺陷的BL-CFCs在形成blast colonies时对VEGF没有反应，集落的数目和大小都明显降低，残留的集落仍有分化为内皮细胞和造血细胞的潜能（26）。因而VEGF/Flk1相互作用可能不是血液血管干细胞发育唯一需求的。但VEGF 和 bFGF 在胚胎发育过程中是调节血液血管干细胞发育的重要因子，VEGF可能在调节血液血管干细胞想造血和内皮细胞分化其重要作用，而bFGF调节血液血管干细胞的增殖。 (23,20,26)2SCL许多研究表明SCL也是血液血管干细胞发育的关键。SCL是碱性螺旋-环-螺旋转录因

14、子。scl-/-小鼠在E10.5天就因造血缺陷而死亡（27,16）。进一步研究表明SCL也是内皮细胞发育所必需的，scl-/- ES不能在卵黄囊内发育为血管网(28)。斑马鱼的后侧中胚层表达SCL，并可以产生造血和内皮细胞（29），当其clooche基因突变时，影响造血和内皮细胞分化，并引起SCL表达明显下降（30）。共同表达Flk1与SCL的细胞，能够产生SCL+/Flk1-的造血细胞和SCL-/ Flk1+的内皮细胞，提示共同表达Flk1和SCL的细胞是血液血管干细胞（29）。当斑马鱼的胚胎SCL表达过量时，SCL+/Flk1+细胞增多，结果也造成内皮和造血细胞增多（29）。SCL缺陷的E

15、S不能形成blast colonies （31），scl-/-的EBs体外有造血缺陷，然而Flk1+的细胞仍能发育（32），与野生型的EBs相比scl-/-的EBs含有较高比例的Flk1+的细胞，其随后又表达内皮细胞的标记(23)。以上结果可以这样解释，当造血分化通路阻断后，血液血管干细胞主要转向内皮细胞分化。综上所述，Flk1和SCL在血液血管干细胞的发育中起关键作用，Flk1+/SCL+的细胞可能就是血液血管干细胞。成体血液血管干细胞研究许多研究表明成体循环中存在内皮细胞的祖细胞，并能掺入到血管的内皮中（33,34）。Lin （35）证明循环中的内皮祖细胞来自骨髓，并具有造血细胞的潜能。P

16、eichev(36) 研究表明，造血来源的CD34+细胞，不仅表达AC133 和 Flk1，还表达内皮细胞特异的表型VE-cadherin ，CD31和E-selectin，在VEGF, FGF-2 和collagen的环境诱导下，增殖并分化为AC133- Flk1+的成熟内皮细胞。另外，高度纯化的骨髓造血干细胞亚群SP(side population，因为此细胞亚群因为不掺入荧光染料，定位在流式细胞图的边群而被命名)，此细胞不仅可以使致死量照射的受者重建造血，而且可以掺入到缺血心肌的血管中分化为内皮细胞(37,38)。以上的研究提示成体内有可能存在内皮和造血细胞的共同祖细胞血液血管干细胞。但

17、一直没有成体血液血管干细胞的报道，直到最近在Nature Medicine和Blood发表的两篇文章，分别在体内和体外研究鉴定了成体内存在具有血液血管干细胞特征的细胞。Grant 等将转染绿荧光蛋白GFP基因的小鼠的造血干细胞（Sca-1+Lin-）移植到放射线照射的受者鼠，可以使受者重建造血，从受者鼠富集的造血干细胞再一次移植到致死量照射的宿主并诱导成视网膜缺血模型，3个月仍可重建造血，证明了此造血干细胞增殖和自我更新的能力。另外， 4个月后，缺血后重新形成的受损毛细血管有绿荧光细胞。因此，可以使造血重建的造血干细胞也能重新形成功能性的血管，提示Sca-1+Lin-造血干细胞具有血液血管干细

18、胞的特性。为了确定是否单个造血干细胞克隆也能参与造血和内皮的形成，作者将分离到的单个gfp+ Sca-1+c-kit+Lin-的造血干细胞移植到同样的致死量照射的受者鼠，20只受者只有3只重建造血，并且所有的三只小鼠的造血干细胞都能分化为内皮细胞并参与新的血管形成（39）。另一篇发表在2002年11月的Blood杂志Pelosi E从脐带血和骨髓分离到的CD34+KDR+的细胞可以产生大量的含有造血和内皮细胞（Hem-End）的集落。而CD34+KDR-的细胞却不能形成。进一步将分离到的细胞极限稀释后，仍能产生这种混合的集落，说明产生的混合集落是克隆源性的，提示此CD34+KDR+细胞具有双潜

19、能的血液血管干细胞的特性。如果将单个CD34+KDR+细胞接种在造血环境中，可以产生4个细胞，分别将这4个细胞接种在产生Hem-End 半固体环境里，可以产生血液血管干细胞集落，若接种在造血的半固体培养基里，只产生小的造血集落。提示血液血管干细胞在不同的环境中有不同的分化能力（40）。而我们实验室也在2002年初从胎儿骨髓分离到Flk1+CD31-CD34-的细胞，将来自单个集落的Flk1+CD31-CD34-的细胞接种在含有VEGF和bFGF的基底膜胶中不仅可以形成血管结构，同时还产生造血细胞样的CD34+的圆形细胞。若将Flk1+CD31-CD34-接种在含造血因子的半固体培养基中，能够产

20、生原始红系细胞。在血管结构还未形成时加入抗血管形成剂苏拉明，不能形成血管，若在血管结构刚刚形成时，加入苏拉明，血管结构消失，而圆形细胞还在原来的血管周围，此结果提示圆形CD34+细胞和血管内皮来自同一细胞，说明Flk1+CD31-CD34-具有血液血管干细胞的特征(41)。成体干细胞可塑性及其机制最近许多研究证实在成体组织内存在多能干细胞，不仅可以跨系分化，还可以跨胚层分化。这即是干细胞的可塑性。对可塑性的机制目前还没共识。主要有以下假说：干细胞的分化潜能被认为是成熟细胞的去分化(deferentiation)，从而具有了干细胞的多向分化潜能。后来对干细胞可塑性的认识，有可能是干细胞之间存在横

21、向分化（transdifferentiation），即干细胞之间的转化。例如，造血干细胞具有的多系分化潜能，是由于造血干细胞转化为其他干细胞如神经干细胞，后者进一步分化为神经元或胶质细胞。最近，Nature发表的两篇文章，在体外培养体系，胚胎干细胞可以与成体干细胞造血干细胞和神经干细胞（42,43）融合，融合的骨髓细胞继承了胚胎干细胞的表型特征。而融合的神经干细胞不但继承了胚胎干细胞的表型，当将其注射到胚泡还显示了其多系分化潜能，并有致瘤性。认为干细胞的可塑性可能与细胞融合有关，但是，此融合现象的发生频率是非常低的，前者只有2-11个/106骨髓细胞，而后者为1个/106。融合现象是否也可能发

22、生在成体干细胞与体细胞的融合，目前还未有报道。我们实验室很早提出成体内存在的具有多系分化潜能的干细胞，可能是胚胎发育过程中胚胎细胞残留在机体不同的组织器官中，并在壁龛的作用下保持静息状态，一旦其所存留的组织受到损伤需要修复，在特定的微环境下被激活并分化为所需的细胞。正是基于这一观点，加之我们分离到的干细胞具有多系甚至跨胚层的分化，我们才认为体内有可能有胚胎发育存留的血液血管干细胞。Jiang (44)从成体小鼠骨髓分离到的间充质干细胞除了能分化为三个胚层的细胞外，还表达胚胎干细胞的标记Oct-4,说明此类细胞具有胚胎细胞的特征，同时也证实了我们的观点是正确的，但是干细胞可塑性的机制仍有待于进一

23、步研究。总之，内皮和造血发育是密切相关的。不仅在胚胎发育中，存在内皮和造血细胞的共同祖细胞即血液血管干细胞，目前的研究也证实成体内存在具有血液血管干细胞特征或功能的双潜能干细胞。这使人们进一步改变了对干细胞的认识：一直被认为只有胚胎发育才有的瞬间存在的血液血管干细胞，也存留在成体内。 更重要的是分离获得成体内的血液血管干细胞，对治疗先天或后天的血管性疾病和血液系统的疾病提供了新的策略，同时也为研究血液血管干细胞分化机制提供了体内外模型。参考文献：1.Alison MR, Poulsom R, Forbes S, Wright NA.An introduction to stem cells.

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