精子中组蛋白甲基化调控的紊乱将通过隔代遗传给子代造成损伤

1、精子中组蛋白甲基化调控的紊乱将通过隔代遗传给子代造成损伤Keith Siklenka, Serap Erkek, Maren Godmann, Romain Lambrot, Serge McGraw,Christine Lafleur, Tamara Cohen, Jianguo Xia, Matthew Suderman, Michael Hallett,Jacquetta Trasler, Antoine H. F. M. Peters,* Sarah Kimmins*前言：尽管，父本也为胚胎贡献一半的遗传信息，但胚胎的起始健康状态的关注点在母本。父本效应被认为与一些癌症，糖尿病，肥胖等

2、复杂的疾病相关。这些疾病发病率皆上升，而仅靠基因不能解释这种现象，这启示通过非基因遗传的表观遗传可能对于疾病的传染具有重要作用。表观遗传体系包括DNA甲基化修饰，组蛋白转录后修饰，非编码RNA。基于人类和动物的研究表明，表观遗传可能在环境诱导的表观特征在子代的遗传中具有重要作用。这些表观特征在第一，二子代中，与改变基因的表达和组织的功能相关联，分别称为代间和隔代遗传。基于此类的父本表观遗传的的机制并不清楚。基本原理：精子的发生包括细胞快速分裂，特定的转录程序，产生具有高度凝聚染色体的泳动细胞。与精子核高度一致，极少的组蛋白的滞留暗示它对发育的作用。尽管是表观遗传的重点，但DNA 甲基化在父本的

3、表观遗传中的作用依旧不清楚。只要在精子的CpG富集的区域所发生的微小的DNA甲基化修饰改变已证明与环境诱导的表观特征的遗传有关。取而代之的是，在涉及精子中组蛋白或RNA状态的改变的父本表观遗传中，这可能存在一种联合作用的分子机制。精子中组蛋白的功能和修饰在胚胎发育，子代健康和表观遗传是不清楚的。通过在小鼠精子发生期过表达人类去除KDM1A组蛋白的第四个氨基酸的甲基化的去甲基化酶，我们培育出了精子发育相关基因中CpG 岛H3K4me2减少的小鼠模型，我们研究了其子代的发育和健康状态。结果：雄性的转基因子代小鼠与C57BL/6品系的雌鼠杂交，培育出实验用的杂合转基因(TG)和非基因改造的(nonT

4、G)的子代。每代中(TG)和(nonTG)分别与57BL/6品系的雌鼠杂交，并研究其子代的代间遗传和隔代遗传效应。我们发现在一代中KDM1A的过表达严重损伤了其发育和其子代的存活。在缺少KDM1A表达的种系中，这中缺陷一直遗传了两代。我们检测了转基因(TG)和非基因改造的(nonTG)的子代的组蛋白和DNA甲基化状态。KDM1A的过表达导致了超过2300 个基因的H3K4me2的缺失，其中包含了许多发育相关的基因。不同于其他父本的转基因遗传案例，我们没有在精子中看到CpG 富集区域的的DNA甲基化的改变。相反，在转基因(TG)和非基因改造的(nonTG)的后代，它们子代及其二细胞期，我们检测到

5、它们的RNA量发生显著而相似的变化。在子代中这些表达水平的改变和所观察到的异常表型与在精子中组蛋白的甲基化水平的改变相关联。这些研究证明，在精子发生期KDM1A对子代有主要启发性的作用，并参与组蛋白的甲基化，精子RNA作为一个潜在的转基因遗传的中介。我们的数据强调转基因表观遗传的的复杂性，这可能涉及多种分子，包括在精子发生期不同染色体状态的形成和精子形成RNA。结论：精子发生期准确的组蛋白甲基化对于跨世代的子代发育和存活具有重要作用。这些发现证明，组蛋白的甲基化可为解释父本的表观遗传的潜在分子机制。由环境诱导的组蛋白的修饰可能改变胚胎的发育进程，导致复杂疾病的时代遗传。一个必须的步骤就是建立功

6、能和环境压力的联系，精子表观遗传学组的图谱，子代中基因表达改变的影响和代谢过程。基于到越来越多的证据，我们很快将得出一个合理结论：未来的父亲保护器他们精子的表观基因组父亲的一生的经历可以传给其子代而影响其发育。但是，这种基于表观遗传的传递机制并不清楚。不像体细胞，在精子中几乎没有核小体，且其表观遗传的功能并不清楚。我们培育出一种过表达H3K4的去甲基化酶KDM1A（也叫LSD1）的小鼠，这种酶在精子发生期可以减少产生的精子中H3K4的二甲基化。过表达的KDM1A一代会出现子代的发育和存活严重受损。这中缺陷会持续的出现在KDM1A缺陷的品系中，且在精子和子代中，伴随相关的RNA谱系的改变。我们研

7、究表示在发育的精子中，组蛋白的去甲基化可激活异常发育的表观遗传，而没有CpG富集区DNA甲基化的改变。在人类婴儿中有3%出生时伴有缺陷，这种缺陷可以由遗传因子或环境压力引起，尽管这其中有50%是先天引起的。尽管父亲也给子代贡献了一半的遗传物质及可能的一些表观遗传信息，但这方面的预防工作的重点却在母亲。基于人类和动物学实验表明表观遗传机制可能在由环境诱导的表观特征的遗传中起作用(38)。这种表观特征已与子一代 、二代或三代的基因表达和组织功能的改变相关(38)。基于世代数和父源，这种现象与代间和隔代表观遗传(Fig.1)。母本和父本的这类效应的遗传与生殖细胞的DNA甲基化改变有关(7, 911)

8、。在精子中，在基因启动子DNA的甲基化并不普遍，但是重复元件多被甲基化(1315)。尽管DNA的甲基化修饰研究是表观遗传研究的重点，但在父本的表观遗传中，它的重要性并不清楚。绝大多数研究报道，在精子中CpG富集区只要较少的发生DNA甲基化，CpG富集区通常认为与环境诱导的表观特征的遗传相关联(5, 7, 8, 10, 11)。父本的世代表观遗传也许与组蛋白的状态、RNA或精子中其他成分的改变相关。在精子形成的最后阶段，染色质经历了大规模的重塑，精子中特异的鱼精蛋白取代大部分的组蛋白，这对精子核产生了广泛的影响(20)。尽管如此，只要小部分的组蛋白（小鼠中约1%，人中约15%）保留在成熟的精子中

9、。最近几项研究鉴定了小鼠和人的精子核小体在整个基因组的分布，但结果有部分不统一，这同Saitouan 和Kurimoto的综述中表述相一致 (22)。利用一种有效的方法打开高度凝集的小鼠精子核，接着用微球菌核酸酶消化和深度测序，我们观察到接近10倍比例的序列定位于与核小体关联的DNA上CpG富集的启动子序列。在小鼠精子中组蛋白的保留是可预测的，主要发生于高CpG密度区和地DNA甲基化密度区，比如看家基因和发育调控基因。在未甲基化的CGIs区的保留在小鼠和人中是保守的。在精子中，看家基因的启动子中保留组蛋白变体H3.3，被H3K4二和三甲基化标记。相对的，精子中发育调控基因的启动子包含H3.3和

10、经典的H3.1/H3.2，被H3K27标记。在胚胎发育，子代健康和表观遗传中，精子中组蛋白的功能和发生的修饰大部分并不了解。在Caenorhabditis elegans中，H3K4me2去甲基化酶的缺失与代间的表型有关，H3K4me2在原生殖细胞的稳定积累有效促使不孕。鼠源中赖氨酸的去甲基化酶Kdm1a，通过催化主要的单和二甲基化的H3K4的去除来调控基因的表达及发育。为研究在精子中滞留组蛋白对于胚胎发育和代间的表观遗传的作用，我们靶向H3K4的甲基化，它是与精子中发育基因相关的表观标记。我们致力于培育出这样的小鼠模型，它可产生参与发育基因的CGIs 区的H3K4me2减少的精子。为达到这个

11、目标，我们在小鼠的精子的发生期过表达了人KDM1A H3K4去甲基化酶，并研究了子代的发育和适应性。由杂合子转基因的父代产生的父代和非转基因的子代中出生的缺陷率，婴儿死亡率及基因表达改变率都上升。我们鉴定了转基因和转基因雄性子代的精子组蛋白和DNA甲基化状态。过表达KDM1A基因与超过2300个基因的H3K4me2 特异丢失有关，包括一些发育调控基因。不同于其他父系的代间遗传案例，我们没有观察到精子的CpG富集区的DNA甲基化的改变。相反，我们检测到在转基因和非转基因子代精子中的RNA转录物存在稳定相似的改变，在子代的二细胞期也有同样发现。在子代中所观察到的表达水平的改变和表型异常与精子中组蛋

12、白甲基化水平的改变相关联。该研究证明精子中KDM1A活性和相关组蛋白甲基化的减少会给子代带来灾难性的后果。另外，我们研究表明组蛋白的甲基化和精子RNA为代间遗传的潜在中介分子。结果转染到雄性小鼠生殖细胞系中的KDM1A基因特异性地过表达我们培育了两种转基因的小鼠细胞系，即在生殖腺特异表达、截短的人源多聚肽链延伸因子的启动子调控下，特异表达人KDM1A H4K去甲基化酶。这个启动子在睾丸生殖细胞中很活跃但在其他组织就不活跃。转入的KDM1A的mRNA出现于精原细胞和精母细胞中，在精子附近的转录水平低。同时观察到转基因标记绿色荧光蛋白也有相似的分布。两种品系的子代的睾丸组织病理学评定揭示，在，从第

13、一期精子发生期到成年的所有年龄段精子的发生皆正常。同样地，基本未影响睾丸和附睾重量及精子数。为了评估DNA的完整性，我们模拟了gH2AX的磷酸化，利用末端脱氧核苷酰转移酶介导的脱氧尿苷的三磷酸化缺口末端标记(TUNEL) 来测定DNA的损害。在转基因和对照动物的精原细胞、静母细胞和精子细胞中，磷酸化的H2AX在细胞内的分布是不同的。但我们并没有在转基因雄鼠检测到TUNEL阳性细胞数的增加。最后，在转基因、非转基因和对照组中LINE-1逆转录转坐子的表达并无差异。总而言之，这些数据表明KDM1A的表达不诱导DNA损伤或基因组的不稳定性。在转基因和非转基因雄性产生的子代中代间遗传的父本效应我们繁育

14、了TG和非TG的雄性，检测在过表达KDM1A健康子代中可能存在的代间和隔代遗传的父本效应。家系和世代图如Fig. 2.所示。雄性的转基因子代与C57BL/6磁性鼠杂交，培育出杂合子TG和非TG的子群。从TG二代到底四代和非TG3代到第五代的雄鼠皆与C57BL/6雌鼠杂交，子代用于研究代间和隔代遗传效应。首先，我们分析了多代TG和非TG的雄性幼崽的发育和存活情况，我们我们检测了出生一窝的数量、重量和性别，并检测了幼崽出生36和48h及出生后6和21天的小鼠。与对照组C57BL/6相比，由TG2-4和非TG3代中雄性产生的子代的婴儿存活率下降了。我们观测到转基因表达对存活力的积累效应：由于连续世代

15、的精子都处于转基因的压力下，在两种品系中转基因子代的存活率皆下降。我们也观察到幼崽中四肢、骨骼和皮肤异常和发育不全者。单个雄性所产生的子代分析表明，上述所产生的现象并不是由少数雄性父本传给子代的异常造成，而是由许多雄性父本将表观遗传的改变传给了不同的子代。而且，子代婴儿的存活和异常率与子代是否从转基因父本获得的转基因无关联。在单倍体的精子的表观基因组中可能发生的频率并不携带真正的转基因，这可能是由于在TG杂合子雄性中，KDM1A在精子发生期不同阶段的生殖细胞中表达活跃，如在二倍体的精原细胞精母细胞。而且，即便在两次减数分裂之后，由于不完全的有丝分裂和减数分裂，单倍体的精子通过细胞间的连接分享m

16、RNAs。结果，尽管只有50%的精子中的转入基因发生转录，但所有的单倍体精子在细胞多核期皆受到了影响。由于转基因的表达限定于发育的生殖系中，非TG雄性子代在发育的精子中并不表达转入的基因，这些数据表明在非TG幼崽中观察到的遗传表型与世代的表观遗传现象有关。C57BL/6母本可能踢出一些它们认为异常的幼崽，我们也许低测了被测幼崽中表型异常率。为了解决这种可能性和进一步鉴定在世代中的发育缺陷，我们对底18.5天的胚胎进行了详细的表型发育分析。每代的转基因TG2-4(F0to F2)和TG3-5(F1to F3)雄性与至少两只磁性交配，用测定的窝崽数、植入前后的损失及异常的幼崽来评估怀孕数。TG产生

17、的子代中，异常者各不相同，且被多个系统影响。发育错误案例有骨骼异常,其包括前后指畸形、脊柱缺陷、露骨结构异常、四肢和体节发育失败。同样，在由非TG3和非TG4产生的子代群中，F2和 F3子代中，与对照组对比，我们观察到明显更高频率可见异常和骨骼缺陷。在F3子代（由非TG父系产生）中的异常者代表代间遗传效应。在几代TG和非TG中，妊娠丢失发生率增加。由非TG5雄性产生的F4子代在18.5天胚胎期未观察到可见异常。为进一步及鉴定股价缺陷的特异性属性和确定在非TG子代所观察到的结果，特异分析一系列子代的骨架异常。这些分析表明在TG和非TG子代中皆存在成骨出错、脊柱缺陷、颅骨缺失或异常。，我们的骨架分

18、析确定，由非TG5雄性产生的F4子代中出现了发育异常的稀释现象。因此，在转基因压力下，经过三代，对可检测到的出生缺陷，在我们的分析中观察到了子代表型正常的正常化。但是，我们可能低测了子代的异常数，也未进行深入的病理学分析，异常数仅限定与在子代中可观察到的缺陷和骨架分析。转入的KDM1A的表达改变了精子H3K4二甲基化为将在子代中产生的发育缺陷和父本中精子的染色质可能发生的改变相关联，利用先前提到的由于分析特异研究精子中高度凝聚染色体方法，我们研究了KDM1A靶标H3K4me2在TG3雄性精子中、同窝出生仔畜和年龄相一致的对照组中在基因组水平的作用。我们用微球菌核酶消化的核小体，再用H3K4me

19、2特异性抗体进行了ChIP，接着进行了ChIP-seq。在阅读-基数-标准化的文库中，与对照组相比，我们观察到在TG3的精子的不同基因的转录起始位点(TSS)区域的CpG序列H3K4me2丰度的减少。为了鉴定发生H3K4me2改变的 (TSS)区在基因组水平的作用，我们估算出了在不同精子样本中在基因组水平围绕TSS上下游250bpH3K4me2的丰度.因为我们已经展示了核小体在小鼠精子CpG富集序列的保留，在精子中，与最高核小体占有量区域相一致，且最有可能将任一编码的组蛋白的信息传给子代。在TG3样品中，8171被H3K4me2标记的TSS区域中有28.7%发生了H3K4me2水平的减少，但是

20、有3.4%的区域表现出温和的上升。H3K4me2主要的下调与已经报道的H3K4me2的去甲基化酶H3K4me2活性一致。核小体关联的DNA直接测序并没有显示在TG3精子有不同水平H3K4me2的TSS区域核小体占有情况的不同，也没有显示出TG3和非TG3小鼠及对照组小鼠一窝幼崽数量上的差异。这些结果排除了在TG3精子的某一位点上H3K4me2的减少情况下，核小体滞留会是引起的损伤原因。为了验证基于特定TSS的H3K4me2水平减少的假设，我们根据CpG的密度和不同的染色质分布，比如组蛋白变体H3.3的占有率和H3K4me3及H3K27me3的水平，对这些区域进行了分类，同样也对对照组的精子进行

21、了测量；这些分布与特异基因的功能相关。我们发现，H3K4me2减少的区域都是CpG富集区，这些表明人的KDM1A的靶标与CpG密度相关。内源性的鼠科动物的Kdm1a特异定位于小鼠精子的TSS区高密度的CpG区。而且，在TG3精子中，与H3K4me2水平未发生改变的区域相比，H3K4me2水平减少的区域鼠科Kdm1a的占有水平更高。这项发现指出，人源的KDM1a特异靶标于内源鼠科KDM1a的特异位点上。以上数据表明，转入的人源KDM1A靶标于这些选择区域，这些区域在精子发生期与内源的鼠科KDM1a广泛相关。就如在对照组测定的一样，H3K4me2减少的TSS区域与H3.3强烈相关。因为在精子中强C

22、GIs的高水平的H3.3与染色质高频率的核小体的转换的一致，在强CGI启动子H3K4me2 水平的减少也许反应了H3K4组蛋白甲基转移酶不能消除TG授予的KDM1A作用，因此在TG3雄性精子核小体转换过程中未能重建H3K4me2的状态。同源基因分析结果表明，转入的基因KDM1A调控一群特异的基因。在TG3雄性中，发生H3K4me2 减少，而H3K4me3高度介导的染色质的基因在不同的胞内蛋白代谢过程中具有重要功能。例如，在TG3精子中，在Pdpk1和E2F6上看到H3K4me2的减少。在胰腺中Pdpk1的消除导致了糖尿病，在其敲出小鼠出现了胚胎发生、生长及神经系统发育受损现象。E2F6的缺失导

23、致骨架缺陷。发生H3K27me2减少且被H3K27me3标记的基因在胚胎发育期间具有不同作用。举例来说，Gsc在TG3精子时期，其H3K27me3、H3K4me和 Kdm1a结合域重叠区的H3K4me2量的减少。Gsc的定点突变导致了小鼠颅骨发育异常和骨骼发育缺陷频率的上升。在基因消除的模型中报道出的让人想起TG1-4和nonTG3-4子代中观察到的表型，尽管与精子发生中组蛋白甲基化的改变关联并不清楚。我们的胚胎期表达基因的同源分析表明，H3K4me2减少的基因参与形态发生、图文形成、系统发育、软骨发育、分解和代谢过程。相反，在TG3雄性中高的和无H3K4me2改变染色质基因分别在精子发生和各

24、种核内过程起作用。这些结果强调了hKDM1A靶向特异的一类易影响子代发育的基因。而且，这类基因与我们的表型相一致，这些表型在转TG雄性的精子发生过程中没有观察到缺陷，但在幼崽中可见。组蛋白H3K4me2的改变不依赖DNA甲基化TG3的精子相发反，nonTG3的雄性精子ChIP-seq分析未显示H3K4me2的占有情况与TG3或对照组的雄性精子的不同。这些数据表明在nonTG雄性子代亲畜所观察到的表型异常与H3K4me2水平的减少无直接相关性，在TG的雄性亲畜的成熟精子的情况相似。已经报道，在一些情况下，KDM1A介导H3K9的单甲基和二甲基化的移除。在不同的体细胞中，H3K9me2是异染色体高

25、丰度修饰，分布在整个基因组的大部分区域。H3K9me2 不分布于H3K4me2 或H3K27me3标记的区域，或与其相互排斥，而H3K4me2 或H3K27me3在精子中含核小体的CGI分布广泛。这种反相关小化了H3K9me2对于TG 和nonTG子代所观察到的胚胎损伤特征父本遗传作用。DNA甲基化的改变与在父本环境压力诱导的表型相关，认为是一种表观遗传的机制。为了证明H3K4me2水平的减少是能引起DNA甲基化的可遗传改变，我们首先利用一种靶标方法来测定TG3(F1) 和nonTG3(F1)同窝出生幼崽精子中的DNA甲基化。在T中，基于CpGs富集元件的靶向选择，并将G3精子中H3K4me2

26、不同甲基化鉴定结果与对照组C57BL/6细胞相比较。通过高质量测序质谱ARRAY分析选择的靶点，用来研究DNA甲基化的改变，高质量测序质谱ARRAY是先将其进行中重硫酸盐转换，再用CpG水平分辨率的质谱进行分析。在24个靶基因中，与对照组相比，我们未能观察到TG3和nonTG3 DNA甲基化发生显著改变(fig. S8)。接着，我们利用减少代表的重压硫酸盐测序(RRBS)对DNA甲基化水平进行了全基因组水平的比较，发现在对照组、TG3和nonTG3精子中主要分布于CpG岛。全基因组的单个CpG位点甲基化水平分析表示，在三个基因型的样本中具有高度的相似性，无明显的基团聚集(fig. S9A)。当

27、测定与基因型显著相关的单个CpG位点时，我们比预期检测到了更多(fig. S9, B and C)。总之，利用靶向测序分析和RRBS，与对照组相比，在TG3和nonTG3转基因鼠我们未发现CpG甲基化水平有显著的改变。这些结果表明在CpG岛的DNA甲基化不涉及分子过程，这产生了我们所观察到的隔代遗传表型。KDM1A的过表达与精子中RNA的改变相关联TG3和nonTG3小鼠的精子的RNA分析表明了一种普遍的非基因改变(Fig. 6)。精子中含有各类RNAs，这些RNAs可以作为父本遗传效应的潜在中介子。我们利用Affymetrix GeneChip ST2.0 Array将TG3和nonTG3小

28、鼠精子的RNAs与对照组进行了比较。这使得我们可以检测到28,000个编码转录本和超过7000的非编码RNAs，其中包括2000个lincRNAs。与对照组相比，TG3和nonTG3精子表现了较明显的RNAs的改变，TG3精子中650 RNAs发生了改变，nonTG3精子中619 RNAs 发生了改变，二者中共同存在的564 RNAs发生了错调，67个为cnRNAs，471个为蛋白编码转录本(table S5)。可预见到能基因激活的组蛋白修饰的减少，与对照组相比，在TG3和nonTG3精子中，99%的不同RNAs减少。在野生型精子中，超过60%的RNA关联启动子被H3K4me3标记，间接地反映

29、了在雄性精子细胞发育前期阶段存在转录活性(Fig. 6B) ，但只有约3% 的RNAs被H3K27me3标记。最后，41个共享的下调转录本与H3K4me2减少的基因相关联(Fig. 6B)。这些结果表明转录本和调控RNAs通过TG3和nonTG3小鼠精子传给了胚胎，并可能参与到子代的表型遗传。TG3和nonTG3小鼠精子在早期胚胎中基因表达发生了改变为理解在TG3精子基因可承受的组蛋白甲基化的改变与胚胎期基因的表达及子代表型是否存在关联存在，我们进行了TG8和nonTG8及对照组雄性二细胞胚胎期的表达矩阵分析。我们选择检测了二细胞期的胚胎，因为就发育时间来看，它们与我们所观察的精子H3K4me

30、2改变相似。我们假设在父本染色体存在潜在的改变，与后续的发育阶段相比，在二细胞期胚胎会至少稀释二倍。在TG8和nonTG8产生的胚胎分别鉴定出874和123 不同表达的RNAs (table S6)。在TG8中转录874RNAs下调的基因中80%上调，nonTG8则有近一半上调。在同窝中的二细胞胚胎期，71个共享基因表达发生改变。而且，TG3精子中110个表达下调的基因在转录起始位点的H3K4me2减少了。这些基因都是被H3K27me3 和H3K4me3标记(Fig. 6, C to E)。在TG3精子期时H3K4me2减少，或H3K27me 或H3K4me3富集，但却在胚胎期发生改变的基因，

31、与在TG 和nonTG 产生的子代所观察到的发育异常相关(Fig. 6E)。这些结果表明，在精子发育过程中引发H3K4me2改变的事件会引起在胚胎期基因表达的改变。讨论这里，我们发现，在精子发生期，染色质修饰分子KDM1A的表达上升会诱导大部分的发育缺陷，这些缺陷在三代中都可遗传的，即便在在非转基因子代缺少转入基因的表达。我们的数据表明，在我们的模型中，在雄性精子发育期的组蛋白甲基化时期，重要的起始事件就已经发生改变，导致子代发育异常。在hKDM1A模型的精子中，组蛋白甲基化在无甲基化改变的CGIs位点发生了改变。TG a和 nonTG 雄性精子和二细胞胚胎子代中，我们观察到RNAs发生了改变

32、Fig. 6)。我们的数据强调隔代表观遗传机制的复杂性，以及可能涉及的分子因素，如在精子发生期染色体的形成，DNA的甲基化以及精子RNA。我们观察到畸变的表型种类很多，包括骨骼和皮肤异常，存活率下降，生长受阻。这种异常见于于多父亲来源的多子代中，而非少数父本产生的多子代中。与非转基因子代的第四代相关的高外显率表型一起，这些观察表明一种引发发育损伤的表观遗传机制。不像在精子发育中表达的hKDM1A以化学突变物或诱导精子或子代表型突变起作用，产生高频率的异常表型。与前面的概念一致，我们利用多种手段检验出没有DNA损伤或染色质不稳定。另外，正常的精子头部形态进一步支持精子染色体的稳定性。人和小鼠的精

33、子组蛋白物改变的突变导致精子头部无凝集。不像之前关于隔代遗传的研究，但是我们采取了几种方法，包括利用RRBS进行的基因组范围的DNA甲基化分析和用Epityper靶向分析来确定TG 或nonTG 精子的CGIsDNA甲基化未发生改变。转基因KDM1A表达诱导TG子代中精子包含CGI的启动子H3K4me2的减少。在精子中H3K4me2水平的减少在高Kdm1a的精子中也观察到。因为nonTG3生产的发育缺陷的子代，TG3动物也一样，在TG3精子中观察到的H3K4me2的减少也许并不直接导致发育缺陷的跨代的表观遗传。取而代之的是，我们的数据表明H3K4me2的分布有串联效应，在精子发生期基因的转录和

34、精子的RNA发生改变。相应的，精子中H3K4me2的改变与携有H3K4me3和H3K27me3的基因表达的改变相关，在精子中一系列的胚胎发育相关基因的CGIs表现正常。相应的，由TG 或nonTG雄性产生的两细胞胚胎期基因表达的改变与精子中组蛋白甲基化相关。这表明精子中组蛋白甲基化的改变可以影响早期胚胎基因的表达。相似地，Snf2h染色体重塑分子Smarca5MommeD4突变体在精子发生期与表观遗传灵敏基因agoutiviable yellow (Avy)相关。就如我们的研究，Smarca5MommeD杂合子的4WT雄子代有各种表型，这暗示在精子发生期正确的染色质调控对子代的适应性和基因表达

35、具有重要作用。我们的数据也提供了精子RNA作为子代表型促进分子的可能性。我们观察到在TG 和nonTG精子的RNA有大量重叠，从对照组所得的不同RNA有85%的相似性。由RNA介导的父本效应已经在线虫中被证实，诱导的病毒性表达导致小病毒RNA (viRNA)的跨代的父本遗传。就如在我们的模型中，WT子代使子代继承得到viRNA分子和免病毒侵染的保护性表型。隔代效应通过处于转基因压力的第三代来分辨，因此这表明表型逐渐的缺失，与我们观察到的结果相一致。但是，如RNA的扩散剂可以促使的隔代遗传表型较低，因为哺乳动物精子细胞在囊胚期其命运是特定的，在受精后发生多细胞分裂。在RNS信号途径受阻时，信号会

36、在细胞分裂过程中丢失直到细胞发生特化。因此，我们建立一个哺乳动物模型，精子中的RNA异常与精子发育期的染色质改变有关。在发育阶段，这些RNA可以作用于染色质调控基因的表达(Fig. 7)。与对照组相比，TG和nonTG s雄性精子中，特异RNA大部分是调控RNA，调控RNA的功能包括调控多能性和分化，指导表观遗传形成。我们知道，是精子将lnRNA传给胚胎，推测这些RNA会影响受精后的基因组。如果lncRNAs在发育的胚细胞中不准确转录，改变的lncRNAs就会传给胚胎，此事基因表达可以被修饰。lncRNAs与染色质调控机器作用，并介导染色质的改变。而且，lncRNAs敲出，在PND20前，导致

37、出生前或后死亡，这在我们的转基因子代中一种普遍观察到的现象。结果我们的数据表明，在精子发生期CGIs位点独立的DNA甲基化和组蛋白甲基化异常与胚胎基因表达的改变和发育相关联。我们关于隔代表观遗传结果表明，在精子发生期，染色质修饰所引起的基因损伤及环境所引起的组蛋白甲基化改变，可能是一种潜在的导致新生儿缺陷和疾病的原因，而这种缺陷和疾病很可能是父亲引起的。个体对环境的反应，遗传的敏感性或疾病的易感性可能受染色体修饰因子数目的影响。1. I. Lobo, K. Zhaurova, Birth defects: causes and statistics. Nat.Educ. 1, 18 (2008).2. T. J. Mathews, M. F. MacDorman, “Infant mortality statisticsfrom the 2005 period linked birth/infant death data set”(National V