Gene diagnosis

1、基因诊断基因诊断Gene diagnosis基因诊断基因诊断1 1、定义：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，、定义：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达是否正常，从而对疾病作出直接检测基因结构及其表达是否正常，从而对疾病作出诊断。诊断。 狭义的概念狭义的概念 对疾病或与致病相关的核酸片段（对疾病或与致病相关的核酸片段（DNA 或或 RNA）的）的确定及核苷酸序列的测定确定及核苷酸序列的测定广义的概念广义的概念 对疾病或与致病相关的基因（对疾病或与致病相关的基因（DNA）的表达产物）的表达产物（ mRNA、蛋白质）的确定和序列测定、蛋白质）的确定和序列测定细

2、胞核细胞核DNA转录转录翻译翻译mRNA蛋白质蛋白质细胞膜细胞膜血清学诊断血清学诊断基基 因因 诊诊 断断生化学诊断生化学诊断临床学诊断临床学诊断临临 床床 表表 现现2 2、疾病类型、疾病类型 内源基因的变异：突变、异常表达内源基因的变异：突变、异常表达 外源基因的侵入：病原体入侵外源基因的侵入：病原体入侵3 3、目的：探寻基因异常改变与疾病的关系、发现外源基因。、目的：探寻基因异常改变与疾病的关系、发现外源基因。4、特点：、特点： 1 1）针对性强）针对性强 2 2）高度特异性）高度特异性 （杂交技术、探针）（杂交技术、探针） 3 3）灵敏度、精确性高）灵敏度、精确性高 4 4）早期快速诊

3、断）早期快速诊断 5 5）适用性强、诊断范围广）适用性强、诊断范围广 （内、外源基因或非活化基因）（内、外源基因或非活化基因）5、临床意义及优缺点、临床意义及优缺点1)1)临床意义：临床意义： 疾病分型疾病分型 优生优育优生优育 组织配型组织配型 鉴别病原体的基因型、明确病原鉴别病原体的基因型、明确病原2 2）缺点：）缺点：可对那些具有组织和分化阶段表达特异性可对那些具有组织和分化阶段表达特异性 的基因及其异常进行检测和诊断的基因及其异常进行检测和诊断 在感染性疾病的基因诊断中，既可检出正在感染性疾病的基因诊断中，既可检出正 在生长的病原体，又可检出潜伏的病原体；在生长的病原体，又可检出潜伏的

4、病原体； 既能确定既往感染，又能确定现行感染，既能确定既往感染，又能确定现行感染， 尤其适用于不易体外培养和不能在实验室尤其适用于不易体外培养和不能在实验室 安全培养的病原体，大大扩大诊断范围安全培养的病原体，大大扩大诊断范围3）优点）优点灵敏度高灵敏度高 无内含子无内含子利用利用mRNA检测检测基因诊断的途径基因诊断的途径 基因突变的检测基因突变的检测 基因连锁分析基因连锁分析 mRNA的检测的检测 基因诊断常用方法基因诊断常用方法核酸分子杂交（核酸分子杂交（hybridization ）聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（single-strand

5、comformationpolymorphism analysis,SSCP) 限制酶片段长度多态性连锁分析（限制酶片段长度多态性连锁分析（RFLP)限制性核酸内切酶酶谱分析限制性核酸内切酶酶谱分析DNA序列分析序列分析(DNA sequence)依据依据DNA双链碱基互补、变性、复性的原理，检双链碱基互补、变性、复性的原理，检测样品中是否存在与其互补的同源核酸序列。测样品中是否存在与其互补的同源核酸序列。 （一）探针（一）探针（probe） 1、定义：一段与被检测的核苷酸序列互补的带、定义：一段与被检测的核苷酸序列互补的带标记的核苷酸片段。标记的核苷酸片段。 一、分子杂交一、分子杂交 1 1

6、）有标记、示踪物）有标记、示踪物 2 2）单链）单链 3 3）特异性高）特异性高 4 4）小片段反应快、灵敏）小片段反应快、灵敏 5 5）选取编码序列）选取编码序列 6 6）灵敏、安全、简便）灵敏、安全、简便2、 探针具备的条件：探针具备的条件：（二）种类（二）种类1、基因组、基因组DNA探针探针 基因组文库中，选取外显子序列，避免高度重复序列。基因组文库中，选取外显子序列，避免高度重复序列。2、cDNA探针探针 理想理想3、寡核苷酸探针、寡核苷酸探针 人工合成的探针，适合点突变分析，反应需时短。人工合成的探针，适合点突变分析，反应需时短。 20-50bp； G-C对对40-60%； 探针内部

7、无互补序列；探针内部无互补序列； 4bp，同一碱基，同一碱基 DNA/DNA，特异性高，特异性高 2）无互补链，杂交效率高）无互补链，杂交效率高 3）无高度重复序列，非特异性杂交少）无高度重复序列，非特异性杂交少 4）杂交后）杂交后RNA可去除可去除,降低本底。降低本底。（三）标记物（三）标记物1 1、高度灵敏性、高度灵敏性2 2、不影响碱基配对的特异性、不影响碱基配对的特异性3 3、不影响探针的主要理化性质、杂交稳定性和特、不影响探针的主要理化性质、杂交稳定性和特异性，异性，TmTm无较大改变无较大改变4 4、酶标时，不影响、酶标时，不影响KmKm、酶活性、酶活性5 5、特异性高、假阳性率低

8、、特异性高、假阳性率低6 6、化学稳定性高、保存时间长、操作简便、无污、化学稳定性高、保存时间长、操作简便、无污染、无害、价格低廉。染、无害、价格低廉。1、放射性核素、放射性核素优点：灵敏性（优点：灵敏性（1010-14-141010-18-18g)g)、特异性高。、特异性高。缺点：放射性污染；缺点：放射性污染； 射线损伤探针分子；射线损伤探针分子； 半衰期短，随用随标，标记后立即使用；半衰期短，随用随标，标记后立即使用； 稳定性差；稳定性差； 反应需要时间长。反应需要时间长。常用放射性核素常用放射性核素（1）32p ATP a、g位标记位标记（2）35S（3）3H（4）125I2、非放射性标

9、记、非放射性标记特点：灵敏度低；稳定、安全、经济、实验周期短。特点：灵敏度低；稳定、安全、经济、实验周期短。（1）生物素（）生物素（biotin） 水溶性维生素，与尿嘧啶环水溶性维生素，与尿嘧啶环C5相连相连 （2）地高辛（）地高辛（Digoxigenin，Dig）免疫酶学检测）免疫酶学检测 类固醇类半抗原，与尿嘧啶环类固醇类半抗原，与尿嘧啶环C5相连，相连， Dig-UTP、 Dig-dUTP 、Dig-ddUTP （3）荧光素；）荧光素；FITC 被被UV激发出荧光观察，主要适用于原位杂交激发出荧光观察，主要适用于原位杂交（4）Amersham 公司公司ECL（增强化学发光自显影，（增强化

10、学发光自显影，enhanced chemiluminescence）Progema公司公司LightsmithTMII Luminescence Engineering System（5）光密度、电子密度标记物）光密度、电子密度标记物 金金 、银、银（四）标记方法（四）标记方法1、体内标记法（、体内标记法（in vivo）2、体外标记法（、体外标记法（in vitro） 酶促标记法酶促标记法 化学标记法化学标记法杂交方法杂交方法固相杂交固相杂交 探针探针 被测被测DNADNA（RNARNA）在固体支持物上杂交在固体支持物上杂交液相杂交液相杂交 探针探针 被测被测DNADNA（RNARNA） 在

11、液体中杂交在液体中杂交 *固相杂交固相杂交相关技术：印迹技术相关技术：印迹技术(blotting)将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化学介质上并加以检测分析的技术。定化学介质上并加以检测分析的技术。DNA blotting (Southern blotting)RNA blotting (Northern blotting)Protein blotting (Western blotting)1、硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜 单链单链RNA、DNA，结合不牢固，结合不牢固2、尼龙膜、尼龙膜 单、双链单、双链RNA、DNA3、化学活化膜、化学活化

12、膜 Northern blot4、滤纸、滤纸固相支持物的选择固相支持物的选择分子杂交技术过程分子杂交技术过程 探针制备及标记（同位素或非同位素）探针制备及标记（同位素或非同位素） 待测核酸样品制备（分离，纯化）待测核酸样品制备（分离，纯化） 杂交（液相，固相，原位杂交）杂交（液相，固相，原位杂交） 杂交后处理（去掉非特异杂交分子）杂交后处理（去掉非特异杂交分子） 显示结果（显色，发光，放射自显影）显示结果（显色，发光，放射自显影） 结果分析结果分析（一）（一）核酸分子杂交（核酸分子杂交（hybridization ）Southern blot:将电泳分离的将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物

13、上片段转移到固相支持物上Northern blotting: 将电泳分离的将电泳分离的RNA片片 段转移到固相支持物上段转移到固相支持物上斑点或狭缝杂交法斑点或狭缝杂交法(dot blotting)原位杂交原位杂交(tissue in situ hybridization)等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法(allele specific oligonucleotide,ASO)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip, DNA array, DNA microarroy)菌落杂交法菌落杂交法夹心杂交法夹心杂交法斑点印迹杂交斑点印迹杂交(dot bloting)：

14、将将RNA或或DNA变性后直接点样于变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品优点：简单、快速、可同时检测多个样品原原位位杂杂交交将标记的核酸将标记的核酸探针与细胞或探针与细胞或组织中的核酸组织中的核酸进行杂交，称进行杂交，称为原位杂交。为原位杂交。ASO法的基本原理：通过位于寡核苷酸探针中法的基本原理：通过位于寡核苷酸探针中部的基因（或序列）特异性碱基与靶序列部的基因（或序列）特异性碱基与靶序列DNA的碱基配对和严格条件下洗膜来达到检测基因的碱基配对和严格条件下洗膜来达到检测基因中少数碱基变化（少至单个碱基）的目的中少数碱基变化（少至单个碱基）的目的寡核

15、苷酸探针与固定在膜上的靶序列寡核苷酸探针与固定在膜上的靶序列DNA之间，之间，只要有一个碱基不互补，寡核苷酸探针就会被只要有一个碱基不互补，寡核苷酸探针就会被洗掉洗掉杂交信号的检测杂交信号的检测一、放射自显影：一、放射自显影： 二、非放射性探针的检测二、非放射性探针的检测 1、偶联反应、偶联反应 ：免疫反应与显色体系：免疫反应与显色体系 2、显色反应：、显色反应： 酶促显色法酶促显色法 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 （AP）BCIP/NBT 辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP） 荧光法荧光法 化学发光法化学发光法二、二、PCR （Polymerase chain reaction）DNA 微量分析

16、微量分析RT-PCR(reverse transcription-PCR)nested-PCRAsymmertric-PCRligase chain reactionmultiplex PCRAS-PCR,allele-specific PCRin situ PCR三、单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCP) single-strand comformationpolymorphism analysis用途：检测点突变用途：检测点突变对象：对象：DNARNAPCR-SSCP三、三、DNA分子多态性分析分子多态性分析限制性长度多态性分析（限制性长度多态性分析（restriction f

17、ragment length polymorphism ，RFLP ）多态性多态性:一对等位基因在人群中出现的频率大于一对等位基因在人群中出现的频率大于 10%的现象（约的现象（约200对对bp有一对变异，有一对变异， 中性突变）。中性突变）。 本质：个体间核苷酸序列的差异。本质：个体间核苷酸序列的差异。限制性片段：限制性核酸内切酶切割后所形成的限制性片段：限制性核酸内切酶切割后所形成的 特异基因片段。特异基因片段。限制性长度多态性：某些原因使得同种生物不同个体限制性长度多态性：某些原因使得同种生物不同个体 间出现不同长度不同的限制性片段。间出现不同长度不同的限制性片段。 点多态性，单个碱基的

18、突变，两点多态性，单个碱基的突变，两 个等位片段个等位片段 酶切位点的改变酶切位点的改变 （多态性）（多态性） 酶切位点位置变化，缺失、插入、重复酶切位点位置变化，缺失、插入、重复原因原因 重复序列重复序列：VNTR多态性，串联重复序列组成多态性，串联重复序列组成HVRs，可变数的串联重复（可变数的串联重复（variable number of tandem repeat，VNTR）。）。 酶切位点随其长度的变化而变化。酶切位点随其长度的变化而变化。nRFLP与遗传病基因连锁在一起与遗传病基因连锁在一起“遗传标记遗传标记” 已知变异，已知变异，Southern blot 酶切图谱直接分析法酶切图谱直接分析法 n分析法分析法 PCR 酶切酶切 产物大小产物大小 （Hbs） RFLP见接分析法见接分析法b b 珠蛋白基因突变所造成的珠蛋白基因突变所造成的RFLP 分析分析镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析基因诊断基