蛋白激酶NEK6调控细胞抗病毒信号转导机制及DNAzyme抗病毒活性研究

1、蛋白激酶NEK6调控细胞抗病毒信号转导机制及DNAzym(抗病毒活性研究抗病毒天然免疫系统是宿主防御病毒感染的第一道防线。病毒感染机体后 , 机体的免疫系统很快启动免疫级联反响激活工型干扰素和多种细胞因子的表达。病毒感染细胞分泌的I型干扰素通过JAK-STAT信号通路诱导周围细胞表达 多种抗病毒基因，这些抗病毒蛋白抑制病毒繁殖，促进感染细胞凋亡。I型干扰素 还可以活化适应性免疫系统 , 从而建立起长期的病毒防御机制。抗病毒天然免疫系统主要通过胚系表达的模式识别受体(pattern-recogniton receptors, PRR) 识别病毒复制过程产生的病原体相关分 子模式 (pathoge

2、n-associated molecular patterns, PAMPs) 。参与病毒 PAMP 识别的PRF主要包括Toll样受体(Toll-like receptor, TLR) 、RIG-I样受体 (RIG-l-like receptor, RLR)和 DNA识别分子。定位在膜结构上的TLR识别病毒成份,通过接头分子MyD88或者TRIF激活下 游信号通路，诱导I型干扰素和炎症因子的表达。胞质中 RIG-I样受体识别病毒 复制产物后 , 迅速招募组装 VISA(virus-induced signaling adaptor) TRAFS/TANK/NAP1/SINTBA复合物活化蛋白

3、激酶TBK1和 IKK蛋白激酶复合物。随后转录因子IRF3和NF- k B活化入核诱导I型干扰素的表达。蛋白质翻译 后修饰如磷酸化和泛素化等在细胞生命活动过程扮演着重要的角色。为寻找调控细胞抗病毒信号转导新的蛋白激酶 , 我们通过克隆表达实验对蛋 白激酶表达库进行了系统筛选并发现一个影响病毒诱导I型干扰素表达的新蛋 白激酶一一Nek6o表达外源Nek6能抑制病毒诱导的ISRE,IFN B启动子的激活并抑制IFNB1及受其诱导细胞因子RANTES勺表达。通过siRNA抑制内源Nek6的表达不仅可以协同仙台病毒对ISRE的激活,而且能显著抑制水泡口炎病毒的复制。我们的生化实验进一步说明Nek6能够

4、以泛素化依赖方式促进活化 IRF3 的降解。我们的研究工作充分说明了 Nek6参与了细胞抗病毒信号转导的负调控过程。 在过表达实验中我们发现Nek6激酶失活突变体失去了抑制活性,这说明Nek6对 细胞抗病毒信号传导的调控是依赖其激酶活性的。过表达条件下Nek6能够对IRF3173位丝氨基酸进行磷酸化修饰。我们拟在 后期通过磷酸位点特异抗体进一步证实内源性 IRF3173位丝氨酸磷酸化在病毒 感染过程中的动态变化。因为Nek6所属NIMA蛋白激酶家族主要参与了细胞 M期的起始,我们拟在后 期开展实验检测IRF3173位丝氨酸磷酸化的水平是否随细胞周期变化。以上研究 工作能帮助我们更全面说明Nek

5、6调控细胞抗病毒信号转导的分子机制。2003年爆发的重症呼吸衰竭综合症 (severe acute respiratory syndrome,SARS是由冠状病毒家族一个新的成员 SARS-CoV引起的。SARSW毒为正义链单 链包膜RNA病毒,基因组大约由30Kb碱基组成,编码14个开发阅读框,两端为高 度保守的非编码区 (untranslated region, UTR) 。目前,我们仍然缺乏对SARS-CoV有很好疗效的药物。DNAS是一类人工合成 对RNA具有切割活性的单链脱氧核酸,根据其催化结构域可以分为10-23和8-17 两种模式。人们已经设计了多个有效抑制 HIV和流感病毒的D

6、NA酶,我们试图设计并筛 选能够特异抑制SARS-Co啲DNABo SARS5 UTR大约有265个核苷酸组成,在分子进化上高度保守 , 在病毒的生活周期有重要的功能 , 因此我们以 SARS5 UTRRNA为靶标设计了 DNAB体外切割实验说明,我们设计的DNA酶Dz-104,而不是其突变体能特异切割 来源SARS5 UTR的RNA我们将SARS5 UTR和绿色荧光蛋白基因融合在一起, 成功构建了靶向SARS5 UTR的DNA酶细胞筛选系统。通过共转染实验,我们发现Dz-104在胞内能特异切割SARS5 UTR并抑制绿 色荧光蛋白的表达。我们的研究工作充分说明了 DNA酶能有效识别并切割SARS 病毒来源的 5非编码序列 RNA。我们拟在后期利用SARS亚基因组复制子检测Dz-104对