刺梨半乳糖磷酸酶基因的表达及其与AsA积累的关系

1、园 艺 学 报 2014，41（6）：11751182 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140114；修回日期：20140409 基金项目：国家自然科学基金项目（31360475，31060257）；贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目（黔省专合字201012）；贵州省重大科技专项（黔科重大专项字20136006-1） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：anhuaming） 刺梨gdp-l半乳糖磷酸酶基因的表达及其与asa

2、积累的关系 孙雅蕾，杨 曼，安华明* （贵州大学农学院，贵州省果树工程技术研究中心，贵阳 550025） 摘 要：采用rt-pcr和race技术，从刺梨（rosa roxburghii tratt）果实中扩增出gdp-l半乳糖磷酸酶（gdp-l-galactose pyrophosphatase，ggp）基因的全长cdna序列，并分析其在不同组织和果实不同发育阶段的表达特点及其与asa积累的关系。结果表明：刺梨ggp基因cdna（rrggp，genbank 登录号：hm998753）包含1个长度为1 341 bp的开放阅读框（orf），编码445个氨基酸；其氨基酸序列与苹果、猕猴桃等的相似性均

3、在80%以上。rt-pcr分析表明，该基因在刺梨不同器官中的表达差异明显：在果实中的表达量最强，叶中次之，而花和茎中只能检测到极微弱的表达。在果实不同发育时期都能检测到rrggp的表达，在发育初期（花后50 d内）表达较弱，花后60 100 d呈高水平表达，而后随着果实成熟而下调。刺梨中rrggp的表达特点与asa积累高度一致，意味着该基因可能是果实发育过程中asa合成的关键基因。 关键词：刺梨；gdp-l半乳糖磷酸酶；基因表达；asa 中图分类号：s 661 文献标志码：a 文章编号：0513-353x（2014）06-1175-08 expression of gdp-l-galactos

4、e pyrophosphatase and its relationship with ascorbate accumulation in rosa roxburghii sun ya-lei，yang man，and an hua-ming* （guizhou engineering research center for fruit crops，agricultural college，guizhou university，guiyang 550025，china） abstract：a full length cdna encoding gdp-l-galactose pyrophosp

5、hatase（ggp），a key enzyme in the putative l-ascorbic acid（asa）biosynthetic pathway of higher plants，was obtained from rosa roxburghii tratt fruits using rt-pcr and race technology. this cdna，designated rrggp（accession number，hm998753），contained an open reading frame（orf）of 1 341 bp，encoding a protein

6、 of 445 amino acids. sequence analysis indicated that its deduced amino acid showed over 80% identities with the corresponding proteins from other plant species. semi-quantitative rt-pcr showed that the expression of rrggp in fruits was significantly abundant than that of in leaves，flowers or stems，

7、respectively，contributing to parallel accumulation of asa. transcript abundance of rrggp in developing fruits showed a development-specific profile，in which rrggp transcript levels were lower in young（1050 days after anthesis，daa）and nearly ripe（110120 daa）fruits，and higher in fruit in mid-developme

8、nt（60 1176 园 艺 学 报 41卷 100 daa）. this expression pattern showed a well correlation with asa level，suggesting an important role of this gene in regulating asa biosynthesis in the fruits. key words：rosa roxburghii；ggp；gene expression；ascorbic acid 抗坏血酸（asa）不仅是果实品质的重要组分，而且还参与植物诸多生理过程。业已证实l半乳糖途径是高等植物asa

9、合成的主要途径（wheeler et al.，1998；hancock & viola，2005；linster et al.，2007），而gdp-l半乳糖磷酸酶（gdp-l-galactose pyrophosphatase，ggp）在该途径中催化gdp-l半乳糖生成l半乳糖1磷酸，是该途径中最后一个被鉴定的酶（laing et al.，2007；linster et al.，2007）。目前该酶的基因已从苹果（li et al.，2010a）、猕猴桃（bulley et al.，2009）、桃（imai et al.，2009）等果树中鉴定和克隆。在拟南芥和猕猴桃上的研究表明，ggp对高

10、等植物中asa的合成与积累起着关键性的作用，并且很可能是l半乳糖途径的限速酶（dowdle et al.，2007；bulley et al.，2009）。遗传转化研究表明ggp过量表达能够提高转基因植物中的asa含量（bulley et al.，2009）。但在草莓（cruz-rus et al.，2011）、猕猴桃（li et al.，2010b）和桃（imai et al.，2009）等的果实以及番茄（ioannidi et al.，2009）、苹果（li et al.，2010a）等的叶片中发现ggp基因与asa合成并未表现出明显的一致性。表明不同植物可能具有不同的asa合成调控机制。

11、以高积累asa的刺梨（rosa roxburghii tratt）为材料，从果实中克隆了ggp基因的全长cdna序列，并对其时空表达特点及其与asa积累的关系进行了分析，为阐明ggp基因在果实合成asa过程中的作用提供科学依据，也为完善这一特色果实合成asa的分子机制提供更进一步的信息。 1 材料与方法 1.1 材料 5年生优良无性系刺梨贵农5号（樊卫国 等，2011）种植于贵州大学刺梨种质资源圃。于2011年7月采集刺梨幼果用于基因克隆。5月上旬采取开放的花朵，7月下旬刺梨asa积累量最大时采取绿色果实、幼嫩茎和叶样品用于不同器官中表达特点的研究。从5月中旬（花后20 d）开始采果实，以后每

12、隔10 d于上午10时定期随机取样，用于不同发育时期基因表达研究。所采样品迅速放入0 左右的保温箱内立即带回实验室，用液氮速冻后于80 超低温冰箱中保存。 1.2 方法 1.2.1 rrggp的cdna克隆及生物信息学分析 采用ctab-licl法（chang et al.，1993）提取总rna，按照revertaidtm first strand cdna synthesis kit（fermentas）进行cdna第一链的合成。根据genbank中已登录的苹果、猕猴桃、葡萄等植物的ggp基因保守序列设计引物（表1）进行pcr扩增。扩增产物回收后连接到pmd18-t载体（takara）上，

13、转化大肠杆菌tg1感受态细胞，阳性克隆经pcr和酶切验证后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。按照takara试剂盒分别进行3和5端扩增并测序，根据所得序列设计特异引物扩增全长cdna并测序验证。 用blastn、blastp、clustalx和mega4.1等分子生物学软件进行序列分析及系统树构建；用protparam tool（http：//tools/protparam.html）分析氨基酸基本成分、相对分子量、等电点等理化性质；利用软件tmpred（http：//software/tmpred_form.html）预测蛋白

14、质跨膜区段；利用signal p程序分析n末端的信号肽序列（http：/genome.cbs.dtu.dk/ services/signal p）；通过psipred预测蛋白质的二级结构，swiss-model预测蛋白质三级结构。 6期 孙雅蕾等：刺梨gdp-l半乳糖磷酸酶基因的表达及其与asa积累的关系 1177 图1 rrggp的 rt-pcr扩增结果 m：dl2000 dna marker；1：cdna片段；2：3端扩增产物； 3：5端扩增产物；4：全长扩增结果。 fig. 1 the rt-pcr amplification results of rrggp m：dl2000 dna

15、marker；1：cdna fragment；2：3 terminal fragment；3：5 terminal fragment；4：full-length cdna of rrggp. 表1 试验所用引物序列 table 1 sequence of primers involved in the experiment 用途 purpose 引物 primer 引物序列（53） primer sequence 刺梨ggp cdna的rt-pcr扩增 ggp1 tcgctatgatgtcactgcttg rt-pcr for rrgpp fragment ggp2 agcattcacttct

16、tggaacct race 引物 ggpf tcgagatgttgaggatcaagagggttcc race primers ggpi aggactatgatgaggcttctg ggpo agatctctgagcttctgaact rrggp全长cdna扩增 ggpu tgccatggtcgagatgttgaggatcaag rt-pcr for full-length rrgpp cdna ggpd gctctagaaccactgatctgctcattact 内参基因扩增 18sf caaatttctgccctatcaac rt-pcr for 18s as internal contr

17、ol 18sr caaaatccaactacgagctt 1.2.2 rrggp的表达分析 分别取刺梨果实和不同器官的总rna样品2 g，用oligo(dt)18作为反转录引物，按照1.2.1的方法合成cdna第一链。以跨内含子引物ggp1和ggp2扩增rrggp的cdna片段，以18s rrna作内参基因。对cdna定量和循环数优化至线性期后进行半定量rt-pcr扩增，分析目的基因在不同器官和组织中的表达量。 1.2.3 asa含量的测定 参考张雪等（2012）的方法提取asa：取2 g组织置于预冷的研钵中，加5 ml 5 mg ml-1的偏磷酸研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中，于12 0

18、00 r min-1离心15 min后，取上清液。以上操作均在4 下进行。asa含量采用高效液相色谱法（hplc）测定，以峰面积外标法计算其含量。asa标样购于sigma公司。4种器官和11个不同发育时期的果实样品至少3次生物学重复。 2 结果与分析 2.1 rrggp克隆及生物信息学分析 以刺梨果实总rna为模板进行rt-pcr和race扩增，分别获得886、832和1 132 bp的预期片段并测序，在此基础上设计全长引物，pcr扩增出与预期长度一致的约1.4 kb特异条带（图1）。经回收纯化后连接到pmd18-t载体，经鉴定后测序。 将测序所得到的1 375 bp cdna序列用相关分子生

19、物学软件进行分析，其包含一个长度为1 341 bp的开放阅读框（orf），编码445个氨基酸。将其命名为rrggp，genbank登录号为hm998753。其推导的蛋白质分子式为c2206h3462n606o666s16，分子量49.64 kd，等电点5.20。该蛋白中相对含量较多的氨基酸是leu（48个，10.8%）、glu（39个，8.8%）和ala（34个，7.6%）；含量较少氨基酸有trp（3个，0.7%）和met（5个，1.1%）等；根据其亲水性推测该蛋白可能是水溶性蛋白质。tmpred预测分析表明，rrggp是跨膜蛋白，有1个胞内至胞外方向的跨膜螺旋区：226 245氨基酸，其中心

20、位于236位氨基酸残基。经signalp分析发现rrggp蛋白不存在信号肽序列。经psipred在线预测刺梨ggp蛋白的二级结构以折叠为主、螺旋为辅，并通过长链转角连接。利用genbank提供的保守结构域数据库对其氨基酸序列比对分析（图2）发现， 1178 园 艺 学 报 41卷 图2 植物ggp基因推导氨基酸序列比对分析（clustal x） 星号表示所有序列具有相同的氨基酸残基，下划线处表示nls序列，方框内表示hit结构域。 fig. 2 alignment of the deduced amino acid sequences of plant ggps by clustal x th

21、e asterisks show the consensus amino acid residues in the seven enzymes. a sequence thought to be a nls region is underlined and a hit domain is boxed. 6期 孙雅蕾等：刺梨gdp-l半乳糖磷酸酶基因的表达及其与asa积累的关系 1179 图5 刺梨不同器官内asa的含量 fig. 5 asa accumulation in r. roxburghii different organs 图4 rrggp在刺梨不同器官中的表达 fig. 4 rrg

22、gp expression in r. roxburghii different organs 该基因在119kkrp122部位含有一个nls（核定位序列，nuclear localization sequence），在240 244氨基酸残基位置有一个hit（histidine triad，组氨酸三联体）结构域。以上生物信息与前人在其他同源基因上的研究结果（dowdle et al.，2007；laing et al.，2007；linster et al.，2007；linster & clarke，2008；mller-moule，2008）基本一致。 氨基酸同源性比对结果表明，rrgg

23、p与苹果（acn88681.1）、蓖麻（xp002530359.1）、猕猴桃（adb85572.1）、毛果杨（xp002298816.2）、大豆（np001240984.1）和西印度樱桃（acg75920.1）等同源基因的相似性分别达到了87%、81%、81%、78%、78%和77%，其n端序列相对保守，而c端序列保守性相对较低。 在此基础上构建的系统分析树（图3），结果表明刺梨ggp基因与苹果、大豆同属一大族，而猕猴桃、西印度樱桃、蓖麻、毛果杨属另一族。 图3 植物ggp基因氨基酸序列的系统分析树 fig. 3 phylogenetic tree of the full-length ded

24、uced amino acid sequences of seven plant ggps 2.2 rrggp在刺梨不同器官中的表达 通过半定量rt-pcr检测刺梨不同器官（果、花、叶、茎）中rrggp的表达模式（图4）发现，在这4种器官中均能检测到rrggp的表达，在果实中的表达最强，叶中次之，而花和茎中只能检测到极其微弱的表达信号。 这种rrggp表达水平的差异与相应器官中的asa含量（图5）高度一致：在表达最强的果实内asa的积累量最高，表达较弱的叶片内asa含量则相应较低，茎中只有极微量的asa，而花中则几乎检测不到。这种一致性在一定程度上表明asa的合成可能受rrggp表达的调控。

25、1180 园 艺 学 报 41卷 2.3 rrggp在果实不同发育时期的表达及其与asa积累的关系 在刺梨整个发育时期的果实中均能检测到rrggp的表达并呈现有规律的变化：发育初期（20 50 d）表达量较弱，之后随着果实的不断发育表达不断增强，在果实接近成熟时（开花后110 d）表达量下调。开花后60 100 d是该基因表达最强的时段（图6），同时也是刺梨果实积累asa最多的时期（图7）。果实整个发育期间rrggp表达与asa积累之间的这种高度一致性，并结合之前在刺梨果实上发现的生物合成过程（而不是循环代谢过程）对asa积累起主要作用的结果（安华明 等，2005a），表明rrggp可能是刺梨

26、果实发育过程中asa合成的关键位点。 图6 刺梨果实不同发育时期rrggp的表达 上栏为rrggp表达的rt-pcr分析（30个循环），中栏表示用相同方法扩增的18s rrna内参基因（20个循环）， 下栏表示等量的总rna电泳图。 fig. 6 rrggp expression in r. roxburghii fruits during development rrggp show ggp expression levels during development；18s rrna show 18s rrna expression levels were examined as an int

27、ernal control for the rna amounts；rna show equal amounts of rna loading. 图7 不同发育时期刺梨果实asa积累量 fig. 7 asa accumulation in r. roxburghii fruits during development 3 讨论 本试验中克隆得到刺梨果实rrggp基因的全长cdna序列，其编码的氨基酸序列与已知的其他植物的同源基因具有很高的相似性，说明该基因在高等植物中是比较保守的。生物信息学分析发现该基因含有一个代表hit超基因家族特点的典型结构域（hhh/q，代表疏水性氨基酸），表明rrgg

28、p基因属于hit超基因家族成员；根据其亲水性平均数推测该蛋白可能是水溶性蛋白质。利用genbank提供的保守结构域数据库对其氨基酸序列进行分析发现，rrggp虽无明显的信号肽序列，但存在一个跨膜螺旋区，说明该基因属于跨膜蛋白；并含有一个nls（核定位序列），这与之前在拟南芥上发现绿色组织的细胞质和细胞核都检测到ggp蛋白的结果是一致的，意味着该蛋白是具有催化和调控两种功能的双功能蛋白质（dowdle et al.，2007）。 6期 孙雅蕾等：刺梨gdp-l半乳糖磷酸酶基因的表达及其与asa积累的关系 1181 目前高等植物合成asa的途径、尤其是l半乳糖途径已基本清晰，但尚不清楚其调控机制和

29、调控位点。较早的研究认为该途径较为上游的gdpd甘露糖3,5差向异构酶（gdp-d- mannose-3,5-epimerase，gme）可能是l半乳糖途径的调控位点和限速酶（wolucka & van montagu，2003），但后来在拟南芥和猕猴桃上的研究表明ggp似乎才是asa合成的重要调控位点（dowdle et al.，2007；bulley et al.，2009）。然而，有意思的是，最近西北农林科技大学马锋旺课题组利用秦美猕猴桃（a. deliciosaqinmei）为材料却发现l半乳糖1磷酸磷酸酶（l-galactose-1-phosphate phosphatase，gpp

30、）基因的表达与asa积累速率呈良好的一致性（li et al.，2010b），而非ggp；李超汉等（2011）采用农杆菌介导法获得了gdp-d甘露糖焦磷酸化酶基因（gmpase）超表达的转基因番茄植株，在常温及低温下其asa含量显著增加；对番茄和苹果叶片的研究还发现gpp在调控番茄果实和苹果叶片asa积累方面起着主要控制点的作用（ioannidi et al.，2009；li et al.，2010a）；而在桃果实中，l半乳糖途径基因的表达水平与asa生物合成之间并未表现出明显的一致性关系（imai et al.，2009）。草莓果实中，l半乳糖途径之外的半乳糖醛酸途径（galua pathw

31、ay）对asa合成的作用更为显著（agius et al.，2003；cruz-rus et al.，2011）。以上研究结果表明，不同植物具有不同的asa合成和调控机制，即使同一基因，它们在不同植物种类中对asa合成的作用效率也不相同。本研究对rrggp的时空表达模式进行分析发现，不同器官中rrggp的表达表现出明显的差异：果实中的表达量最强，叶片中次之，而花和茎中只能检测到极其微弱的表达信号，其转录水平与相应器官中asa积累量完全一致；同时，刺梨果实不同发育时期rrggp的表达量变化也与其中asa的积累规律保持高度一致，尤其是在asa的积累速率最快的60 100 daa期间，rrggp的转

32、录量也达到整个发育期的最高水平。有趣的是，结合之前安华明等（2005b）、an等（2007）以及最近的研究（数据暂未发表）发现仅有ggp和位于l半乳糖途径最末位置的l半乳糖酸1,4内酯脱氢酶（l-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，galldh）基因表现出类似的规律，但前者的表达量要远远高于后者。以上结果表明rrggp极有可能是刺梨果实高含量asa合成的关键基因。 下一步拟通过遗传转化研究进一步验证ggp对asa合成的调控作用、与galldh和其他合成基因之间的协同机制以及对环境因子的响应特点等方面的研究有望提供更多信息。 references agius

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