目的基因的连接与转化

1、分类及原理分类及原理分类分类： 根据限制性内切酶酶切后产生的末端根据限制性内切酶酶切后产生的末端的类型，分为非互补突出末端的连接、相的类型，分为非互补突出末端的连接、相同粘性末端的连接、平末端连接同粘性末端的连接、平末端连接DNADNA连接示意图连接示意图载体自连及去磷酸化载体自连及去磷酸化常用碱性磷酸酶常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIAP(小牛肠)分子量 80,000温度 60 65最适PH8.0热稳定性好，100 暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活分子量 100,000温度 37 最适PH10.0附近（高底物浓度）PH 8.0附近（低底物浓度）6530分钟处理99的活性不可逆

2、失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理本实验连接材料及连接本实验连接材料及连接体系体系连接示意图连接示意图连接体系连接体系载体DNA 17 ng目的DNA 50 ng连接缓冲液（5） 1.2 ul用蒸馏水稀释至6ul附注：附注：目的DNA的总体积是3ul，如果不够总质量以总体积为准1. 1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为为8 8：1 1到到1 1：1616，但通常的变化范围是，但通常的变化范围是3 3：1 1到到1 1：3 3。插入片段的长度。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果

3、。每一个连接反应都需要和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用积中，通常一个连接反应用10-50ng10-50ng的载体的载体DNADNA。2. 2. 进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连接在接在2222保温保温4-164-16小时，粘性末端在小时，粘性末端在2222保温保温3 3小时，或小时，或1616保温保温1616小时。大多数连接反应用小时。大

4、多数连接反应用T4DNAT4DNA连接酶，但大肠杆菌的连接酶，但大肠杆菌的DNADNA连接酶可用连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。 3. 3. 载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是不是TETE，毕竟，毕竟TETE中含有离子，可能影响连接反应。中含有离子，可能影响连接反应。感受态细胞的制备感受态细胞的制备HanahanHanahan法是制备高效感受态细菌的标准方法。法是制备高效感受态细菌的标准方法。这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可

5、达到这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到10109 9 cfu/ cfu/g DNAg DNA。注：注：1.1.低温培养，低温培养，1818培养至培养至OD600约为约为0.5； 2.2.超净台无菌操作，低温操作；超净台无菌操作，低温操作； 3.3.标准质粒的种类不同同种感受态的转化率不标准质粒的种类不同同种感受态的转化率不同，不同质粒形态转化率也不相同。同，不同质粒形态转化率也不相同。转化原理转化原理1. 0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2. 加入DNA

6、，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；3. 经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，大大提高了大肠杆菌的转化效率。转化示意图转化示意图连接效率的计算连接效率的计算连接效率连接效率=转化子数转化子数载体质量载体质量(个/ ng)转化效率转化效率(个/ ng)100%载体自连及去磷酸化载体自连及去磷酸化转化原理转化原理1. 0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2. 加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；3. 经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。Mg2+的存在对D