实验六菌落总数的检测

1、实验六菌落总数的检测一、实验目的1、掌握培养基配制、灭菌方法、无菌操作及接种等基本技术；2、掌握食品中菌落总数测定方法及菌落计数方法。二、实验仪器与器材1、仪器：恒温箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、微波炉、均质器。2、材料：吸管（容量为0. ImL、lm和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、灭菌平 皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镇子。3、试剂：营养琼脂培养基、75%乙醇、0.85%生理盐水。三、实验原理菌落（colony）是指细菌在某一种固体培养基上克隆增殖发育成肉眼可见的 细菌集团。菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得ImL检样中所 含菌落总数。通常以cfu/g （mL,

2、cm2）表示，cfu代表的是colony forningunite菌落总数是作为判定食品的清洁程度（被污染程度）的标记，通常越干净的 食品，单位样品菌落总数越低。反之，菌落总数就越高。菌落总数的测定是以每个 活细菌能克隆增殖形成一个可见的单独菌落为基础的，但是在实践中除了单个细胞 形成菌落外，二个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌 落总数（而不是活细菌数）或菌落形成单位数表达。由于菌落总数的测定是在 37C有氧条件下培养的结果，对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下 不生长，有特殊营养要求的细菌也受到限制。因此，这种方法所得到的结果，实际 上只包括一群在普通营养琼

3、脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总 数。但由于在自然界这类细菌占大多数，其数量的多少能反映出样品中细菌的总 数，正因为如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。四、实验内容1、平板计数琼脂（plate count agar, PCA）培养基的配制及灭菌（1）培养基配方胰蛋白陈酵母浸膏葡萄糖琼脂蒸憾水pH5. 0 g2.5 g1.0 g15. 0 g1000 mL7. 00.2（2）计算每组配制200ml平板汁数琼脂培养基，汁算出各组分用量。（3）称量按配方称量各种组分，分别置于小烧杯中，注意标记名称。（4）溶化向盛有酵母浸膏的烧杯中加入少量蒸僻水，加热融化，便溶解

4、边搅拌；向盛有琼脂的烧杯中，加入所需水量1/3的蒸镭水，加热溶解，便溶解边搅拌；将酵母浸膏溶液倒入琼脂溶液中，再加入胰蛋口腺和葡萄糖，继续加热，使 药品全部溶化混匀。（5）定容：将溶液倒入量筒中，补足水量（为防止凝固可用热水）。（6）调 pH 值：用 0. lmol/1 NaOH 或 HCL 溶液调 pH 至 7. 07. 2。（7）分装、加塞、包扎。2、检样稀释及培养（1）以无菌操作将检样25g（25mL）剪碎放于装有225mL灭菌生理盐水和玻璃 珠的三角瓶内，经过充分振荡或均质处理制作成1： 10的均匀稀释液（固体食品有 的需先用灭菌研钵研磨后再稀释）。（2）用ImL灭菌吸管吸取1： 10

5、稀释液ImL,沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌 生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管混合均匀，作 成1： 100稀释液，按上述操作顺序，作10倍系列稀释液，每递增稀释一次，即换 用1支ImL灭菌吸管。（3）根据食品卫生标准要求或对标本污染悄况的佔计，选择23个适宜稀 释液，分别在作10倍递增稀释同时，吸取该稀释度的吸管移取ImL稀释液于灭菌 平皿内，每个稀释度作两个平皿。（4）稀释液移入平皿后，应及时将融化并冷却到46C营养琼脂培养基注入 平皿约15mL,并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基注入加有无菌生 理盐水的灭菌平皿内作空白对照。（5）待琼脂凝固后，翻转平板，

6、置36+loC温箱内培养24+2hr （肉、乳和蛋 品为 48+2h,水产为 30C48+2h）。3、菌落计数方法将培养24h后的平板取出，选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数 测定标准，一个稀释度使用两个平板，取两个平板的平均数，乘以稀释倍数，即得 每克(或毫升)样品所含菌落总数。(1) 平板菌落数的选择选取菌落数在30300个之间的平板作为菌落总数测定的标准，且一个稀释 度应使用两个平板的平均数。其中当一个平板有较大片状菌落生长时，若片状菌落 不到平板的一半，而其余一半中菌落分布乂很均匀，即可计算半个平板后乘2以代 表全皿菌落数。(2) 稀释度的选择A. 应选择平均菌落数在3030

7、0之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。B. 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300个之间，则视二者之比如 何来决定，若其比值小于2,应报告其平均数；若两者之比大于2,则报告其中较 小的数字。C. 若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数 乘以稀释倍数报告之。D. 若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最底的平均菌落数 乘以稀释倍数报告之。E. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。F. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或 小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。4、菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，釆用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法讣算，为了缩短数字后面的零数，也 可用10的指数来表示。5、实验结果（1）将实验得到的菌落总数结果记入