树形分子.doc

1、树形分子树形分子(dendrimer)是20世纪80年代出现的一类新型合成大分子。由于 分子本身具有独特的结构，赋予其各种功能而成为高分子领域的研究热点之一。 树形分子在结构上表现出精确的分子组成、高度支化的结构、分子内存在空腔、 分子量具有可控性、分子本身具有纳米尺寸、表面带有大量官能团等特征。树枝 状大分子与传统的线性大分子相比有以下几个显著特点：(1)树枝状大分子有明确的分子量及分子尺寸，结构规整，分子体积、形状和功能基都可在分子水平上 精确控制；(2)树枝状大分子一般由核心出发，不断向外分支，代数较低时一般 为开放的分子构型，随代数的增加和支化的继续，从第四代开始，分子由敞开的 松散状

2、态转变为外紧内松的球形三维结构分子内部具有广阔的空腔，分子表面具有极高的官能团密度；(3)树枝状大分子有很好的反应活性及包容能力，在分子 中心和分子末端可导入大量的反应性或功能性基团，用作具有特殊功能的高分子 材料。树枝状大分子特殊的结构赋予其与线型分子不同的物理和化学性能。树枝状大分子具有广阔的应用前景，可用于生物制药、催化剂、物质分离技术、自组装 及“光天线”等各个领域。1.0以氨基酸为单体的树形分子树状多肽(peptide dendrimer)广义的定义指所有包含多肽的树枝状大分子,树状多肽具有一般树枝状大分子的普遍特性，如规则的多分支类球型结构、密集的 表面集团、分子中较大的空腔等8，

3、11 。它相对于线性多肽具有更好的水溶性、 更强的耐水解酶能力和对细胞更小的毒性，其上众多的结合位点可以结合更多有 用的基团，因此树状多肽在生物化学、分子生物学及化学生物学中具有很广阔的 应用前景。1963年Merrifield首先介绍了固相多肽合成法，该方法简便易行,至今已经发展 成为合成多肽、寡核苷酸甚至某些有机小分子的通用方法。 1988年Tam首先介 绍了以赖氨酸为核心的树状多肽的合成。发散法合成树状多肽多采用此法，具体的合成步骤与线型多肽相同。通常合成 开始于以di-Boc或di-Fmoc保护的赖氨酸合成二级或三级的分支结构，然后其 它多肽序列被一步一步合成到该赖氨酸骨架上。合成结束

4、后，将所得的树状多肽从树脂上切割下来，进行进一步的提纯和表征。除赖氨酸外，Crespo等人介绍了以顺式 4-氨基-L-脯氨酸(Amp)为分支单位的树状多肽。分步发散合成法的一个变体是在赖氨酸骨架上连接不同的肽链，该问 题通过使赖氨酸的a和&氨基端具有不同的保护基而解决，通常分别为BOC和Fmoc1。2.0生物可降解树形分子和所有的聚合物医疗一样，以树形分子为基础的药物载体的尺寸大小，分子 量决定了它们在血液循环中的存留时间，累积在肿瘤处的量和从体内清除的速 率。制作生物可降解的树形分子可以在提高分子量的同时增加在肿瘤出的积累， 提高循环时间，并通过在体内的降解而得以清除。生物可降解的树形分子通

5、常含 有酯键，可以通过化学水解，也可以通过特定酶的作用而降解。Grin staff等成功合成了不同代数的聚甘油-丁二酸poly(glycerol-succi nic acid)(PGLSA)树形分子，这种树形分子中还有大量的酯键和醚键。并研究了其在 体液环境中的降解行为。结果表明还有酯键的分子比含有酰胺键的分子降解的速 率要快很多。2可以通过生物和化学作用降解的PGLSA de ndrimerFig.1-7 biodegradable PGLSA den drimerCleavage by Hydrolysis + j Esterases 丿yX rxf图1-13.0憎水性树形分子所有的基于聚

6、合物的药物载体都要求其良好的水溶性，以方便血液注射。而 增加树形分子内部的憎水性可以大大增加其载药量并提高增溶的药物在体液运 输环境中的稳定性。特别的，具有疏水的核和亲水的表面的树形分子是一种良好 的结构，这和两亲行聚合物组成的胶束类似，但是其稳定性较高，因为不必担心注射后由于浓度的突然下降而造成的胶束的解离。Frechet3等人报道了以4，4-二(4-羟苯基)戊醇为单体合成疏水性树形分子，并在其表面修饰750分子量的聚乙二醇，从而得到两亲性的树形分子。 这种图1-2具有两亲性结构的 Dendrimer4.0聚酰胺-胺类树形分子 PAMAM （poly amido-amine）:4.1发展历史

7、及合成方法聚酰胺-胺（PAMAM ）是最早被合成并商业化的树状大分子。PAMAM的合 成由一个脂肪胺（例如乙二胺或丁二胺等）与丙烯酸甲酯的Michael addition，得 到一个甲酯基结尾的中间体，这个中间体可以被转化为COOH，NH2，OH结尾的最小代数的分子。这个中间体与过量乙二胺（EDA）继续反应就可以得到表面 有4个氨基的G0分子。重复这个过程就能得到高代数的单分散的 PAMAM分子。 但由于树状分子采用重复增长手段合成，要得到高代数产品需要十几步反应而且 每一步要有高产率合成才有意义，产物的提纯也比较困难。另外文献报道的合方 法，高代产物的合成周期长，合成成本也大，致使产品价格非

8、常昂贵，从20世纪80年代中期出现至今仍然没有被广泛地投入商业化应用4。随着代数的增加，通过这种发散性合成的方法碰到了空间位阻的问题。这种现象表现在分子量分布的大幅度的上升和其他的一些方面，这在合成G7的分子中观察到，被称为是Gennes堆积效应。而合成G10以上的树形分子几乎已经不可能5, 6, 7。HiCClb H5CCH；图1-3 PAMAM 合成的一般路线J emiinnl Group除了 PAMAM树形分子,及其表面改性的分子外，PAMAM Dendron-linearpolymer hybrids，也不断涌现出来。其中最为常用的以聚乙二醇为线性单元的聚 合物，这种合成方法用双端基为

9、氨基的聚乙二醇为核，在其两端进行控制增长而得到的。比起单纯的PAMAM，这类分子的毒性和引起免疫的能力更低8。4.2特点龙飞等测定了树枝状高分子PAMAM （聚酰胺2胺型，乙二胺为内核）及其季 铵盐在水溶液中的特性粘度G.结果表明，PAMAM的G在代数G= 23处 有最大值，而其季铵盐则在此处有最小值.同时发现高分子的流体力学等效圆球 半径R G随G增大近似线性增长9。张波等通过对不同代数的树状高分子材料的热重曲线研究表明，树状高分子 材料的热分解行为为逐层分解。在树状高分子中，半代产物外层分解温度较高，在 200r左右，而整代产物外层分解温度较低，从加热开始即发生分解1。曲祥金等研究发现随着

10、PAMAM代数的增加，荧光峰位置没有变化，但相对强 度变化较大，在浓度相同的情况下，随着代数的增加，整代PAMAM的荧光强度除 4.0 G外,由a到d依次减弱,4.0 G的荧光略强于3.0 G。这是由于树枝状化合 物PAMAM在低代时，链间的自由运动空间逐渐增大,在3 G时分子密度达到最 小，分子链的舒展程度最大。进一步增加代数，分子内部结构也变得更加紧密趋向 于一个较为坚硬0的球体，荧光强度又开始增加。他们同时发现 p H对PAMAM荧 光强度的影响较大，荧光物质为弱酸或弱碱时，溶液pH的改变对荧光有很大的 影响。PAMAM树状大分子显弱碱性，为了探讨pH对荧光强度的影响，他们配制了 不同p

11、 H值的一系列溶液，测定了其荧光强度的变化，当p H为8 9时,PAMAM 溶液的荧光强度较大。溶液在酸性或强碱性时，荧光强度都会相应减小I11。4. 3应用PAMAM树状大分子在药物载体、毛细管气相色谱固定相、纳米复合材料、 催化剂、高分子材料的流变学改性剂、废水处理、单分子膜、光电传感、基因载 体等多方面已显示出广阔的应用前景12。Roberts13等以45 mg/g-1的剂量小鼠静脉注射G3, G5, G7阳离子型PAMAM,给药后每隔2 h观察1次，结果发现小鼠不仅体重无明显变化而且行 为也无异常表现。Kukowska-Latallo等将PEG化的三聚氰胺 PAMAM以不同剂 量注入雄

12、性C3H大鼠体内,检测尿素氮的含量，结果无明显变化。将PEG修饰的 酯基末端PAMAM以1.3mg/g-1的剂量注入小鼠体内，器官病理学检测无明显改 变。Bhadra等14将PEG2 5000修饰的G4 PAMAM作为52氟尿嘧啶的药物载 体,尾静脉分别注射相同剂量的 52氟尿嘧啶、 G4 PAMAM2 52氟尿嘧啶和 PEG25000修饰的G4 PAMAM2 52氟尿嘧啶,发现血药峰浓度依次分别为 200220, 21 23 和 6 7mg L - 1,给药后 12 h PEG2 5000 修饰的 G4 PAMAM2 52氟尿嘧啶组血中仍可检测到药物浓度，提示PAMAM载药后具有明 显的缓释

13、作用。Asthana等以角叉菜聚糖引发的大鼠脚水肿为模型，以PAMAM作为非甾体抗炎药氟布洛芬的药物载体，结果发现静脉给药后4 h 75%的大鼠症状减轻，8 h后仍有50%的大鼠症状减轻。而氟布洛芬静脉给药后 3 h发挥最佳 疗效，65%的大鼠症状减轻 ，4 h后只有低于 50%的大鼠症状减轻 ，表明 PAMAM作为静脉注射给药的药物载体能够延缓药物的释放 ，达到缓释的目的。Kong15等将PEG修饰的PAMAM作为甲氨蝶呤肿瘤靶向给药载体 ，与游离药 物相比，肿瘤抑制率提高了 2.1倍。Chandrasekar等将叶酸修饰的G4 PAMAM作 为模型药物吲哚美辛的靶向药物载体，发现炎症部位的

14、血药浓度、滞留时间以及半衰期均高于游离药物吲哚美辛。Shukla等将叶酸硼酸盐修饰的 PAMAM作 为靶向肿瘤的药物载体，结果表现出明显的肿瘤靶向性。上述研究提示，PAMAM经修饰后可作为介导药物主动靶向输送的靶向药物载体并控制药物释 放、延长药物的滞留时间。PAMAM以其特殊的结构，较小的尺寸和表面大量的官能团等性质，弓I起了 研究人员的广泛兴趣。李亚鹏，赵义丽等通过乙二胺与丙烯酸甲酯的迈克尔加成 反应成功合成了不同代数的PAMAM树枝状大分子。他们研究了树枝状大分子 的紫外及荧光性质，发现整代的树枝状大分子和半代的树枝状大分子由于端基不 同，从而导致其紫外吸收峰位有明显的区别， 而其吸收强

15、度是与分子骨架有密切 关系的。同时PAMAM树枝状分子的荧光强度是随着代数的增加而逐渐增强 16 o积极拓展其在生物和药学领域中的应用，这从评价其毒性和引起免疫的能力（immunogenicity）开始的。Axel等利用所得超支化聚合物作为 PMMA的粘度调节剂,解决了因超 支化聚合物端基为极性基团而与本体不相容所引发的问题。 Hong等采用超支化 聚合物作为低密度聚乙烯纤维的加工助剂，降低了共混体系的粘度，降低了材料 挤出所需功率，节省了能源，同时也减少了熔体破裂和鲨鱼皮现象 ，提高了材料 的力学性能17。胡晖等人采用原子转移自由基聚合法（AT RP）制备了不同支化度的超支化 氯甲基苯乙烯（

16、PCMS）,并以PCMS为引发剂,再次运用ATRP聚合甲基丙烯 酸-N, N -二甲氨基乙酯（DMA）,得到核为超支化聚合物，外层为环境敏感性聚 合物PDMA的功能高分子。该方法可控制超支化分子的尺寸和外形 ，从而控制 药物在体内的释放和分布18。王瑜，王春磊等通过发散法合成了各代聚酰胺 2胺（PAMAM）树状大分 子。处理胜利油田孤岛四号联合站污水实验表明 ，合成的3. 0代PAMAM树 状大分子除油效果最佳，除油效果好于现场使用的进口药剂罗曼哈斯 ，在加剂量 为70 mg/ L时，含油从888. 7 mg/ L降到132. 5 mg/ L ,除油率可达到 85. 1 % , 悬浮物从138

17、 mg/ L降到73 mg/ L19。刘军安等通过在3. 0 G树状大分子PAMAM外围修饰十八碳酰长链，以获 得外围疏水、内核亲水的新型树状大分子，考察其作为基因载体的转染效率。通过控制十八碳酰的用量，将十八碳酰修饰在树状大分子外围，应用外光谱和1H NMR对目标产物进行表征，结果表明树状大子外围能够接上十八碳酰长链。在 基因转染过中能够更好的结合 DNA ,从而提高基因转染效率20。陈枫等合成了不同代数 GO （零代）、G2（二代）的树枝状大分子PAM AM, 同时对GO、G2代PAMAM 进行了季铵化改性，得到了 PAMAM 季铵盐,进一 步用PAMAM季铵盐插层改性钠基蒙脱土（ Na+

18、 MM T）得到了 PAMAM 季铵 盐改性蒙脱土（ PAMAM/ MMT） 。XRD分析表明，PAM AM 季铵盐己与 Na+-MMT中的Na+进行了离子交换,同时提出了 GO、G2代PAMAM 季铵 盐对M MT的双分子和单分子插层模型。进一步研究了 PAMAM/M MT对聚 碳酸酯(PC)的流变性能的影响规律，结果表明PAMAM/M MT 可明显降低聚碳 酸酯熔融剪切粘度，有利于提高其加工性能21。周婷等用发散法合成以乙二胺为核的聚酰胺一胺 (PAMAM 0.56.0 代)。 研究发现随着添加剂 PAMAM的增加，铝酸钠溶液的表面张力急剧降低，半代 数的PAMAM具有较好的表面活性，有望

19、成为新一代的表面活性剂；整代数的 PAMAM也有一定的表面活性。PAMAM属于非离子型表面活性剂，因此随着 PAMAM的加入，铝酸钠溶液的电导率改变不大22。杨云云等用发散法合成1- 5代PAMAM大分子及PEG化PAMAM,采用 I R、NMR、端基滴定、GPC等方法对其进行表征，并以阿霉素为模型药物, 比较PAMAM和PEG2 PAMAM载药能力及释放效果。结果FTI R、NMR、端 基滴定、GPC测定结果表明所合成的产物确为 12 5代PAMAM树状大分子,IR测定结果表征 PEG化PAMAM合成，PAMAM大分子及 PEG2 PAMAM对难 溶性药物具有较强包载能力，其中PEG2PAM

20、AM能够更好地延缓药物释放。结 论PEG2 PAMAM大分子具有良好的作为难溶性药物载体的潜力 23。陆珺珺等研究PAMAM树状聚合物对灯盏花素体内药代动力学的影响。测定和比较了 G1、G1.5、G2、G2.5代PAMAM 在不同浓度和不同 pH时对灯 盏花素的增溶量；另将12只大鼠随机均分为 2组，每组6只，分别以灯 盏花素及灯盏花素-PAMAM灌胃，采用反相高效液相色谱法检测血浆药物浓 度。在pH小于7.0时，PAMAM 树状聚合物对灯盏花素的增溶量随着 PAMAM 代数、浓度和溶液pH的增加而增大，其增溶机制为灯盏花素的羧基与PAMAM的伯胺和叔胺发生静电作用；灯盏花素、灯盏花素-PAM

21、AM 口服给药 的 Cmax 分别为(119.65 .36) 和(518.17 7.07) ng mL-1AUC0-8 h 分 别为(370.09 63.08) 和(1 219.47 201.87) ng h mL-两者具有极显著性差 异(P 0.01)。说明PAMAM能显著提高灯盏花素在水中的溶解度；大大改善 灯盏花素口服给药的生物利用度 鬥O申毅等使用PAMAM树形分子处理油墨废水。 研究了树形分子的代数溶 液的酸度以及树形分子的加药量对色度和COD去除率的影响 研究表明PAMAM树形分子对油墨废水具有良好的治理效果在pH值为5. 0左右PAMAM 投加量为 20 mg / L的条件下色度

22、和 COD去除率可分别达到98. 6% 和 98. 3%25Duncan和她的团队报道了 G1-G4PAMAM 对三种肿瘤细胞的作用，发现 PAMAM分子在细胞中培养72小时后，树形分子表现出明显的毒性，IC50的数 值分布在 50 到 30011 g/mL 之间。把 B16F10 murine melanoma cell line 培养在 G4-NH2 dendrimer (5 1 g/mL)的溶液中时，为一个小时后发现了细胞的死亡。 PAMAM的这种毒性归因于表面大量的氨基电离而造成的聚阳离子效应，随着 PAMAM的代数，浓度，培养时间的增加，这种毒性有明显的上升趋势。而将 PAMAM表面

23、的氨基转化为其他带负电荷或是中性的基团的时候，这种毒性大幅度的下降26。而表面为氨基的PAMAM却是小分子药物或是DNA片段的优良载体，通常客 体分子和dendrimer本身通过静电或配位作用可以形成 complex，这大大提高了 客体分子的承载数量。Kohle27等人研究了表面为氨基的 PAMAM分子与布洛 芬(ibuprofen)的作用。氨基可以通过和药物分子中的羧基的离子作用，而增强 其在树形分子中的承载量。Ibuprofen分子不仅可以增容在树形分子的空腔内部， 也可以在表面形成作用。平均每个表面为氨基的PAMAM分子可以增容多达78个客体分子，远远大于表面为羟基的聚酯超支化分子。马丽

24、芳等合成新型树状大分子聚酰胺胺一泊洛沙姆 (PAMAM-Poloxamer)，考察其作为药物载体的可行性。 将泊洛沙姆188 一端羟 基以硫酸二甲酯甲基化，另一端羟基经过对硝基苯基氯甲酸酯活化，与PAMAMG2.0连接，目标产物 PAMAM-Poloxamer用FT IR、1HNMR 进行结构表征。MTT研究其细胞毒性。通过体外增溶实验研究该药物载体对难溶抗癌药 物喜树碱的增溶作用，以及pH对增溶作用的影响；通过光敏性试验研究其对喜 树碱光敏性的稳定能力。通过上述方法成功合成树枝状大分子 PAMAM-Poloxamer，其细胞毒性与PAMAM 相比有所降低；对喜树碱有较好的 增溶作用；对喜树碱

25、光不稳定性具有很好的稳定作用。树枝状大分子 PAMAM-Poloxamer有望成为一种新型药物载体材料27。PAMAM分子进入细胞内部的速度也是非常快的。Kannan等人也使用ibuprofen 作为模型药物来研究 PAMAM 进入 A549 human lung epithelial carci noma的过程。PAMAM-NH2和PAMAM-OH可以在一个小时内进入细胞， 快于超支化聚酯进入细胞的速度(需要两个小时)。如果将ibuprofen通过化学键 作用，并通过 FITC 进行荧光标记，则 PAMAM 分子进入细胞的速度会更快，仅 仅需要 15分钟左右 28。通过化学键连接的药物 -P

26、AMAM 可以增加其在体液环境中的稳定性，除此之 外，还可以降低药物引起的免疫， 并通过连接基本身的性质来调控药物释放的速 率。虽然这方面的研究工作已经有广泛的开展， 但是仍有许多具有挑战性的问题 存在。Duncan等人将3.5GPAMAM分子和顺铂(cisplatin)反应得到了树形分子-铂的化 合物，产品在水中的溶解度很大， 并在体外实验中反先铂有缓慢的释放。 同时也 发现Dendrimer-Pt在肿瘤处聚集的数量是单纯药物的 50倍，但是同时药性也有 明显的降低(小 3-15 倍)29。化学键结合的树形分子 -小分子药物化合物的释放行为也有其特点，因为其进 入细胞的速率更快， 所以带来的

27、治疗作用也有明显的区别与传统线性聚合物的特 点。Jayant J. Khandare31 等人比较研究了 PEG-drug complex和 PAMAM-drug 的 释放行为，使用己二酸作为连接基，用 pacitaxel 为模型药物。对比两者的释放 曲线，因为连接基的相同，两者的释放速率并没有出现明显的差别。PEG-drug的毒性要比纯药物的低，归因于分子量的增加和较慢的进入细胞的速率。而 PAMAM-drug 比纯药物却要高出 10倍，这是由于 PAMAM-drug 进入细胞较快的 速率。1.4 展望目前, PAMAM 已与许多药物如非甾体抗炎药、 抗癌药物、 抗菌药物等通过某 种或多种载

28、药机制形成复合物 ,并已作为新一代药物载体用于不同给药途径。随 着研究的深入 ,树枝状聚合物也将引起生物医学领域学者的广泛关注。但是,目前临床前研究发现树状高聚物仍存在一定的细胞毒性 ,通过对其结构进行修饰以减 少其毒性将是今后研究的方向和重点。1.5 论文提出的背景及意义树形分子因为其规整、 明晰的分子结构， 单分布的分子量， 以及分子内的空 腔结构，作为纳米载体和药物控制释放体系有很好的发展前景。 树形分子因为合 成制备过程周期长， 要求高，所以目前的研究热点更多得集中在已有的树形分子 的改性及功能化的研究上。本文设计、合成了具有 pH 敏感的以聚酰胺 -胺 （PAMAM ）树形分子为基础

29、的纳米载体体系，并进行了小分子的包覆及释放研 究。第二章实验部分2.1实验原料与试剂聚乙二醇单甲醚2000 (mPEG2000), aidrich，使用前使用甲苯共沸干燥除水或 90C真空干燥；对羧基苯甲醛(CBA)纯度95%, sigma-aldrich；氯化铵NH4CI,分析纯，国药，80C干燥过夜后使用；N-二环己基碳二亚胺(DCC);对二甲胺基吡啶(DMAP ),多肽合成级，上海吉尔生化；2.2合成部分2.2.1 mPEG-A 合成将 mPEG( M w=2000)和 CBA (5 equiv)溶解于 THF 中，将溶有 DCC(4 equiv)的DCM溶液逐滴加入到上面溶液中，室温搅

30、拌2小时后加入DMAP (1 equiv)，持续搅拌48小时。结束后过滤去副产物 DCU，溶液浓缩，沉淀在大量乙醚中,干燥后，在异丙醇中重结晶，得到白色粉状固体。DCC DMAPTHF RT 48hr222 mPEG-A与PAMAM大分子的连接PAMAM溶解于少量的DMSO中，加入定量的mPEG-A的氯仿溶液，在 敞口瓶中将溶液加热至沸腾，持续48小时，期间需要要补充加入氯仿。结束后, 浓缩溶液，加入少量的异丙醇，沉淀于大量的乙醚中，得到白色固体。产物重 新溶解在超纯水中，使用超滤的方法除去过量的聚乙二醇链。2.2.5 PAMAM-Ab-PEG 的合成取PAMAM-A-PEG （按照223.4

31、合成），溶解于甲醇中，加入3倍摩尔当量 的NaBH4,室温搅拌24小时，反应结束后，加入超纯水稀释，转移至透析袋中， 先对10mM HCl透析3小时，再对水透析6小时，得到的溶液冻干，得到白色 固体粉末，收率58%。NaBH4MeOH RT图3-3合成PAMAM-Ab-PEG 的反应式Fig. 3-3 syn thesis of PAMAM-Ab-PEG2.2.3 PAMAM-GLY-OH 的合成取500ulPAMAM-NH 2甲醇溶液（质量分数10%左右），在30C旋转蒸发,去除溶剂，使用差重法求得PAMAM-NH 2-4G的重量，重新溶解在二甲基亚砜中取摩尔当量十倍于PAMAM的缩水甘油溶

32、解于5mL的DMSO中，在氮气保护下，冰水浴中，将其逐滴滴加至上述溶液中，保持低温一小时后恢复至室温， 持续反应二十四小时。反应结束后将溶液用超纯水稀释，转移至截留分子量为1000的再生纤维素透析袋中，对超纯水透析 48小时，每隔6小时，换一次透析外液,透析后的液体冻干，得到白色絮状固体，收率 79%NH2OOH48hrDMSO/RT图3-1合成PAMAM-GLY-OH 的反应式Fig. 3-1 synthesis of PAMAM-GLY-OH2.2.4 PAMAM-PEG 的合成mPEG的活化：取mPEG(Mw=2000)4g，甲苯共沸除水，溶解于二氯甲烷中(10mL)，加 入3倍摩尔当量

33、的氯甲酸对硝基苯酯和三乙胺，室温搅拌反应48小时。反应结束后，滤去产生的三乙胺盐酸盐，使用旋转蒸发仪浓缩，沉淀在乙醚中，干燥沉 淀，得到淡黄色粉末，采用异丙醇重结晶，收率 72%。称取活化的mPEG(290mg,3 equiv),溶解于DMSO中，加入溶解有PAMAM (50mg, 1 equiv)的DMSO(1 mL)溶液和三乙胺(催化量)，室温搅拌反应4天， 可以取少量的反应溶液使用茚三酮来检测反应终点。反应结束后，将溶液在高温(95C)高真空(-0.1 MPa)下浓缩，加入5mL的氯仿，在大量乙醚中沉淀， 干燥沉淀。将沉淀重新溶解在超纯水中，用截留分子量为10Kda的离心超滤管浓缩，去除

34、过量的mPEG，得到的溶液冻干，得到白色固体粉末，收率52%。T olueni?/DCVITEAKT 72hrN02pamam-nh2DMSO/RI图3-2合成PAMAM-PEG 的反应式Fig. 3-2 synthesis of PAMAM-PEG2.3表征部分2.3.1红外液膜法，将溶解的样品涂覆于溴化钾晶片表面，烘干，留下一层液膜，用于 红外分析，使用仪器型号 扫描范围4000-400cm-12.4核磁仪器型号溶解仪器型号2.2.4.2 Zeta电势及粒径测定Zeta电势：将样品溶解于缓冲液，用220nm的滤膜过滤一次，使用Malvern激光粒度仪测定；粒径测定：温度3.2.6分子量测定

35、使用Viscotek凝胶渗透色谱（配备有激光散射检测器）测定，流动相为N，N-二甲基甲酰胺，流速1 mL/min , 40C3.2.9 树形分子对 RB 结合量的测定不同量的 RB 和三种不同的树形分子共同溶解在水中， 搅拌 1 小时后，冻干， 得到的红色粉末分散在氯仿中，搅拌过夜，得到的液体静置 30分钟后，通过离 心以除去 RB 的聚集体，得到的氯仿溶液使用旋转蒸发仪去除溶剂，残留物重新 溶解在 100mM 的 NaCl 水溶液中，使用盐酸将溶液 pH 调低直至红色沉淀析出， 离心得到沉淀，干燥得到的内酯式 RB 溶解于 pH=7.4 的 PBS 中测定吸光度，以 此确定树形分子结合的 R

36、B 的量。3.2.10 释放曲线的测定将一定量的摩尔比 5：1 的 RB 和树形分子溶解于超纯水中，静置 30 分钟让 RB 充分吸附在树形分子的空腔中，然后冻干。冻干得到的红色粉末溶解于事先 设定好的缓冲液中，进行紫外光度测定，记下 545nm处的吸光度，定为100%, 然后将溶液转移至截留分子量为14kDa的透析袋中，对20mL的缓冲液透析，每 隔一定的时间后取内液进行紫外光度测定，得到的 545nm 处的吸光度与初始的 吸光度之比即为保留的 RB 的百分数，并更换透析外液。准备下一个时间段的透 析与测定实验。 在 pH=3.0 时， RB 的保留程度由透析到外液中的 RB 的量进行计 算

37、得到。每隔一定时间取 1mL 的透析外液，加入稀释的 NaOH 水溶液，调整溶 液pH，然后由545nm处的紫外吸光度计算得到透析到外液中 RB的量，进一步 得到保留在透析袋内部的 RB 的百分比。第三章实验结果与讨论3.1分子设计设计了具有pH敏感特点的以PAMAM树形分子为基础的纳米载体体系（如 图2-1所示）。树形分子和表面的PEG通过一个疏水基团相连接，以增加包覆在 PAMAM空腔中的客体小分子的稳定性。疏水基和PAMAM分子之间的连接键具有pH敏感性，当pH降低时，此连接键断裂。整个体系分为两部分，一部分 是PAMAM分子，一部分是带有一个疏水端基的 PEG。此时包覆在空腔中的分 子

38、因为没有了表面疏水基团的稳定作用，将迅速地逃逸到外环境中。Rose Bengal（ RB玫瑰红 四氯四碘荧光素）是一种常用的染料，它的钠盐 经常被用来给受损的角膜细胞和结膜细胞染色，从而用来检测眼睛的受损。特定 结构的RB可以被用来治疗癌症和皮肤病。其中一种命名为PV-10的药物已经进 入临床检测阶段，用来治疗恶性黑素瘤和乳腺癌。RB有着很好的水溶性36%（w/v），其pKa值也较低，其羧基的pKa值是3.9，酚羟基的pKa值是4.768。 在本文中选用RB作为客体分子来研究基于PAMAM树形分子的载体体系。RB 与PAMAM树形分子的电荷作用也是考察的重点。(a)(b)图2-1基于PAMAM

39、的pH敏感载体体系a)疏水链的存在可以将小分子稳定在体系内b)pH降低体系水解释放出小分子Fig. 2-1 pH-se nsitive nano-carrier system based on PAMAM3.1合成与表征PAMAM 4G 树形分子的表征 1H NMR S =3.153.53.02.52.0mPEG-A是由聚乙二醇单甲醚和对羧基苯甲醛进行酯化反应的到。酸的量大大过量于聚乙二醇，是为了让聚乙二醇尽量反应完全。酯化反应使用常用的缩合 剂N， N-二环己基碳二亚胺（DCC）,使用对二甲胺基吡啶（DMAP ）作为碱性 酰化催化剂，在无水的条件下进行反应。产物的纯化可以采用在乙醚中沉淀和在

40、 异丙醇中重结晶的办法，因为聚乙二醇在上面两种溶剂中的溶解性较低。产物使 用1H NMR 表征，如图所示，在3 =9.98处出现的单峰是末端醛基 C上的H，在3 =8.16 和3 =7.99处出现的两个双峰分别是对取代苯环上的H，在3 =4.7出现的单峰是溶剂峰（D2O）,在3 =4.49出现的三重峰是聚乙二醇羟基末端C上的H，在3 =3.87处出现的三重峰是与其相邻C上的H，从3 =3.79到3 =3.42处出现的多重峰是 PEG重复单元H的峰，在3 =3.31处 出现的峰是聚乙二醇末端甲基上的H。把体系中残留的小分子除去是比较容易的，而将未反应的聚乙二醇从 mPEG-A中除去十分困难，所以

41、得到的产品实际是 mPEG 和mPEG-A的混合物，由于mPEG的存在不会影响下一步反应，并没有进行进 一步的纯化。mPEG-A的含量通过1H NMR谱图（图2-12）积分计算为86%。OdeH of PEGCDCIH of PAMAMb caJ I)S79.08.58.07.51086420H，在 3 =8.05 和 3 =7.76 处PAMAM-A-PEG （在S =8.32处处出现的单峰是亚胺基上的出现的峰分别是对取代苯环上的H，在3 =7.28处出现的峰是溶剂峰（氯仿），在3 =4.46处出现的峰是聚乙二醇羟基末端 C上的H，在3 =3.82处出现的峰是出现的三重峰是与其相邻C上的H，

42、从3 =3.75到3 =3.42处出现的峰是 EG重复单元H的峰，从3 =3.13到3 =2.12处出现的峰是 PAMAM上的H。）2-3.35处 出现的信号来自于 PAMAM 树形分子内部各个 重复单元的H，因为受到NH单元活泼氢的信号干扰，区分不明显。可以看出图2-13是PAMAM 和 mPEG-A 的信号的叠加， 2.3-3.5处产生的信号是PAMAM 中-CH2-CH2-的各种氢，标志亚胺键形成的 8.3处的信号峰，这来自于碳氮双键上 与碳相连碳的信号。而3 =9.9处的醛基上氢的消失，也代表了反应的成功进行。值得一提的是，与PAMAM相连的苯环的信号峰的峰形的变化，mPEG-A的1h

43、NMR中3 =7.9和8.1处的两个双重峰是对取代苯环的标志，而在 PAMAM-PEG 的1H NMR 中，对取代苯环的峰变成了较宽的单峰。baOH of PEGD2O111111 r9876cH of PAMAM1 I I 1 I B I54321类似 只是S =8以上没有峰，且苯环上的H向低化学PAMAM-Ab-PEG 与 PAMAM-A-PEG 位移移动说明反应成功。PAMAM-Ab-PEG 分子中各种所处环境不同的 C如图标出。由谱图可以看出在 42.03和 42.14处出现两个双峰，这两个峰为 PAMAM分子末端的两个C的信号，有报道 证明PAMAM-NH 2末端C的信号在43.7p

44、pm,如果参与了反应则会在 42.5处出 现，而且与其相邻的C更为接近。在我们的谱图上没有发现43ppm左右的信号， 所以就此我们可以判断PAMAM-NH 2表面的胺基都参与了反应。No peakPAMAM-GL Y-OH在S =3.67和3 =3.46处出现的峰分别是表面羟基C上的H,在3 =3.37处出现的峰是 C-N键上C上的H。在从3 =2.81到3 =2.23出现的多峰是聚合物 PAMAM上的（PAMAM-PEG （在3 =4.69出现的峰是溶剂峰（D2O）,在3 =4.06和3 =3.70处出现的多重峰是PEG重复单元H的峰,在从3 =3.66到3 =3.46处出现的峰是 PEG分

45、子中的H，在3 =3.24H，在从3 =3.37到3 =2.61处出现的峰是聚合物处出现的峰是聚乙二醇末端甲基上的PAMAM 上的 H。）3.2分子量及水溶液中分子尺寸测定4020RddrsA-2-4-60 .I1II1I1I1I0246810retention volume(mL)PAMAM-A-PEG的分子量测定在凝胶渗透色谱仪上进行，配备小角和直角光散 射检测器，流动相为DMF，以聚苯乙烯为标样进行校正。Mn Mw PDI得到的数均分子量 Mn为171804Da,重均分子量为 Mw为244951Da,分子 量分布PDI=1.426。PAMAM-A-PEG 的理论数均分子量为 148615

46、Da,这比测定 的结果要小一些，这是由于使用激光光散射的方法测定的分子量一般偏大的缘 故。Diameter (nm)图3-11 PAMAM-NH 2的粒径测定Fig. 3-11 Size of PAMAM-NH 28Diameter(nm)WFrsneLP图3-12 PAMAM-GLY-OH 的粒径测定Fig. 3-12 Size of PAMAM-GLY-OHVFrsnpDiameter( nm)图3-13 PAMAM-PEG 的粒径测定Fig. 3-13 Size of PAMAM-PEGDiameter( nm)yvkneLP图3-15 PAMAM-A-PEG 的粒径测定Fig. 3-1

47、5 Size of PAMAM-A-PEG树形分子在水溶液中的大小的测定是在 pH=7.4 的 10mM 的 PBS 缓冲溶液 中，使用动态光散射的方法测定，如图 3-12-图 3-16 所示。 PAMAM-NH 2 的平均 直径为 4.6nm，PAMAM-GLY-OH ，PAMAM-PEG 和 PAMAM-A-PEG 在相同条件 下进行测定的结果分别为8.4nm, 15.0nm和13.5nm,都有不同程度的增大。对 于 PAMAM-GLY-OH 而言，水合直径的增加主要归因于一个胺基转变为四个羟 基,表面亲水基团的增加使得粒径增加。对于 PAMAM-PEG 和 PAMAM-A-PEG 而言,

48、表面聚乙二醇长链的引入是整个分子尺寸增加的主要因素。 聚乙二醇（分 子量2000）的水合直径在3.2nm,如果简单得将聚乙二醇的水合半径乘以二再加 上PAMAM的直径来计算PAMAM-PEG的直径，得到结果为11 nm左右，这比 PAMAM-PEG 的实测结果要小 4nm 左右。引起计算和实测结果偏差的原因可归 结于聚乙二醇构象的变化。 水溶液对于聚乙二醇来说是良溶剂, 水分子与聚合物 链的作用要强于聚合物链之间的作用,聚乙二醇分子在水溶液中承蠕虫状的构 象,有不同程度的卷曲。而连接在 PAMAM 表面的聚乙二醇链由于排布紧密, 聚合物长链趋于伸展, 所以整个分子的尺寸会增加一些。 这也从一个

49、侧面反应出 PAMAM4G-NH 2表面的大多数胺基大都参与了反应。 对于 PAMAM-A-PEG 来说, 在 PAMAM 表面增加了一个分子的情况下,水合半径反倒比 PAMAM-PEG 要小 一些,原因在于连接在 PAMAM 表面的疏水基团的相互作用,使得 PAMAM 本 身采取了一种更为紧密的构象,造成整个分子尺寸的下降。PAMAM-A-PEG 的 pH 敏感型水解在 pH 为中性的条件下,普通的脂肪族的亚胺键是不稳定的,在水溶液中的 亚胺键也会分解, 通常在有机合成中得到的脂肪族希夫碱一般不进行分离而直接 进行下一步的反应。 但是如果有苯环的共轭作用则希夫碱的稳定性会得到很大的 提升67

50、。在 pH=6.8 的微酸性条件下,亚胺键也会水解断裂,虽然引入苯环会和 亚胺键形成n - n共轭而增加其稳定性，但是微酸的条件仍会使其水解断裂。图 2-20是在pH=6.8的水溶液中静置5分钟后冻干得到的1H NMR , S =10.1处的醛 基上的氢出现，而S =8.0和8.2处的脱离PAMAM的对取代苯环上的氢也得以体图2-20部分水解的PAMAM-A-PEGFig. 2-20 partially hydrolysis of PAMAM-A-PEG图2-21为原始的PAMAM-A-PEG分子和溶解在pH=5.0的盐酸水溶液5分 钟后冻干得到的水解的产品的红外吸收光谱图，1650cm-1处

51、的小峰认为是碳氮双 键的特征峰，使用pH=5.0盐酸溶液处理后的PAMAM-A-PEG分子，这个特征峰 消失，而只有酰胺键中C-N单键的伸缩振动峰。图2-21使用HCI处理后的PAMAM-A-PEG 分子与处理之前的FTIRFig. 2-21 FTIR spectra of PAMAM-A-PEG before and after treati ng with acidic solution3 代 PAMAM-A-PEG 和 4 代 PAMAM-A-PEG 的分子在 PBS pH=7.4 缓冲溶 液中的zeta电势，由于PAMAM分子表面有电中性的聚乙二醇的覆盖， zeta电 势几乎为零(1.

52、32mV 1.83mV)。PAMAM(3G)和 PAMAM(4G)分子在 pH=7.4 的 PBS缓冲液中的zeta电势分别为10.10mV和25.9mV。而在酸性溶液中(pH=5.2), 亚胺键迅速断裂，PAMAM表面不再有聚乙二醇覆盖，并且 PAMAM的表面胺 基在这种条件下质子化，使得 zeta电势上升(16.7mV 44.7mV)。亚胺键在胺基 质子化的条件下不易形成，使得反应不可逆。3.3.4树形分子对RB的结合能力通过RB树形分子在不同溶剂中溶解性的不同可以帮助研究树形分子对RB的结合能力。醌式的RB可以溶于强极性溶剂，但是在极性中等的溶剂中却是溶解度很低，比如在氯仿中RB就会聚集

53、沉淀。PAMAM本身在氯仿等极性较低的 溶剂中溶解度也较差。聚乙二醇分子可以看作是两亲性的分子， 它在水和氯仿中 都有较大的溶解度。合成的三种树形分子中PAMAM-PEG和PAMAM-A-PEG在 氯仿中有很好的溶剂度，而且结合在树形分子中的RB也会获得在良好的溶解度， 而没有结合的RB则可以通过过滤的方式除去。在测定 RB浓度的时候为了除去 PAMAM本身对紫外光谱的影响，可通过加大量 NaCI的方法将PAMAM和RB 的作用降低，并将溶液酸化，使RB转变为内酯式，进一步降低其与PAMAM的 作用并且从溶液中沉淀出来，从而纯净的 RB进行紫外刚度测定，确定树形分子 结合的RB的量。从图3-1

54、7中可以看出，每个 PAMAM-PEG和PAMAM-A-PEG 对RB的结合量分别为172和183。RB分子中的羧基和PAMAM树形分子中的 三级胺的电荷作用在其结合在树形分子中起到了至关重要的作用，通过盐和转变RB分子结构的方式能打破此电荷作用。PAMAM-A-PEG对RB的结合能力比PAMAM-PEG略强，这可能是由于 PAMAM分子表面引入疏水基团的原因。因 为PAMAM-GLY-OH在氯仿中的溶解性也很差所以这个方法并没有反应出其对 RB结合数量的真实情况。图3-17三种树形分子增溶 RB的能力nedlo rnno vdn ODFig. 3-17 encapsulation abili

55、ty of three types of dendrimers336 RB分子的释放行为为了研究三种树形分子和RB的结合体在不同条件下的释放行为，使用透析 的方法进行研究。选用合适的透析袋可以保证只允许小分子 RB从透析袋内扩散 到透析袋外，而使结合在树形分子上的 RB留在透析袋内。释放的RB分子的数 量通过紫外分光光度法进行测定。首先考察了三种分子在 PBS( 100mM NaCI)中的释放行为。纯净的 RB的 释放作为参照。从图3-22中可以看出PAMAM-PEG和PAMAM-GLY-OH两种分 子结合的RB的释放曲线和游离的RB几乎没有区别，显示出很快的释放速率在 8个小时左右就能达到9

56、0%以上，在15小时的检测终点几乎没有 RB可以保留 下来。这样快的释放速率可以归结为在较高的离子强度下，RB和PAMAM分子中的三级胺的电荷作用被大大减弱，正如前面讨论的这种电荷作用是PAMAM结合RB的主要驱动力，在大大减弱这种驱动力情况下，RB是很容易脱离树形分子内部的，而且这个过程的速率和外接链的长短并无关系，长链的PEG并没有阻止RB脱离PAMAM分子内部的能力，这一点和 klotz plot显示的结果并不 十分一致。这可能是由于klotz plot反应的是平衡态时的体系的状态，并不能体 现动态的情况。而对比来说结合在 PAMAM-A-PEG上的RB的释放要慢一些， 在检测终点仍然能获得15%的保留。这原因来自于 PAMAM周边引入的疏水基 团对结合在其空腔内的RB起到了一定的保留作用。100- PAMAM-A-PEG80-PAMAM-PEGPAMAM-GLY-OH-t Free RB-20246810121416time (h)60o4% BDUauHTSP图3-22三种树形分子在 pH=7.4 PBS (100 mM NaCl) 的释放曲线为了证实电荷作用是RB结合PAMAM分子的重要驱动力，在盐浓度极低的 情况下进行了透析释放试验，缓冲液选用5mM的tris-HC