第五章其他分离方法

1、2021-9-23第第5章章 其它色谱方法其它色谱方法2021-9-23纸层析和柱层析法纸层析和柱层析法薄层色谱薄层色谱高效毛细管电泳高效毛细管电泳超临界流体色谱2021-9-23纸层析纸层析2021-9-23一、纸层析分离过程一、纸层析分离过程 纸层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。 纸层析流动相的移动是依靠毛细作用。 将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。Rf 值相差越大，分离效果越好 2021-9-23二、操作技术1.层析纸和层析板特制的色层滤纸。按需

2、要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。2021-9-232.展开剂 由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。2021-9-233. 点样 用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。2021-9-234.显色、检测 有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。2021

3、-9-23三、特点及应用三、特点及应用 平板色谱简单、方便、及操作费用低，平板色谱简单、方便、及操作费用低， 可以在一块层析板上同时展开多个试样及可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。将多条滤纸同时展开。 采用方形薄层板还可以方便的进行二维展采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。剂再次展开，进一步改善分离效果。 试样一般不需要经过预处理即可分离。试样一般不需要经过预处理即可分离。 2021-9-23 缺点： 分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。 应用：应用：

4、平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。2021-9-23柱层析2021-9-23柱层析：是吸附色谱的一种，它利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗脱分离的一种分离方法。 微型柱层析实验2021-9-23实例实例:n凝胶过滤层析纯化细胞色素C2021-9-23一、目的要求一、目的要求1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯化2021-9-23二、原理二、原理n凝胶过滤层析也称分子筛层

5、析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。2021-9-232021-9-23n优点：a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用n凝胶的类型：Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel ABio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D70015003时, 形成

6、双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。2021-9-234. 分离过程分离过程 电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。2021-9-235.5.分离类型分离类型八种分离类型八种分离类型(1)(1) 毛细管区带电泳毛细管区带电泳（CZECZE

7、） 最普遍、最基本的一种分离模式。(2) (2) 毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGECGE） 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。2021-9-23(3) (3) 毛细管胶束电动色谱（毛细管胶束电动色谱（MECC） 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组

8、分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。2021-9-23二、仪器装置二、仪器装置 电压：030KV。 分离柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：10-1910-21 mol/L）2021-9-23三、影响柱效的因素及改进方法三、影响柱效的因素及改进方法热效应热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。电渗流控制电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小

9、和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。2021-9-23四、主要特点和应用四、主要特点和应用高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质.试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。不足之处：不足之处：进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较

10、长。2021-9-23超临界流体色谱一、一、超临界流体色谱的特点与原理超临界流体色谱的特点与原理feature and principle of SFC二二、超临界流体色谱仪的结构流程、超临界流体色谱仪的结构流程structure and general process of SFC 三、超临界流体色谱的应用三、超临界流体色谱的应用application of SFCsupercritical fluid chromatograph, SFC2021-9-23Berger(产地：美国产地：美国)超临界流体色谱仪超临界流体色谱仪(SFC) 技术参数技术参数 1.流量0-70ml/min2.改性剂

11、0-100%3.多阶程序升温4.压力程序主要特点主要特点1.分析速度比HPLC提高3-10倍2.溶剂成本是HPLC的1/3-1/403.可以连接气相的FID检测器,也可连接液相的UV,DAD等检测器，更有MS检测器4.杰出的手性化合物分离能力5.精密的超临界流体控制技术2021-9-23JASCO(产地：产地： 日本日本)超临界色谱仪超临界色谱仪(SFC) 技术参数技术参数 1.流量范围:0.001-10ml/min 2.最高压力:30MPa 主要特点主要特点1.与泵一体的泵头制冷装置设计便于操作 2.独有的SSQD系统,确保了被输送介质的流速稳定 3.泵头电子冷却装置保持泵头温度低于 4 4

12、.系统控制单元包括各种操作模式,如加入有机改性试剂 2021-9-23一、一、超临界流体色谱的特点与原理principle and character of supercritical fluid chromatography1.1.概述概述 超临界流体超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。 超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1 1）可处理高沸点、不挥发试）可处理高沸点、不挥发试样；样；（2 2）比）比LCLC有更高的柱效和分离有更高的柱效和分离效率。效率。2021-9-232. 超临界流体性质（1 1）性质

13、介于液体和气体之间）性质介于液体和气体之间; ; 具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。者之间。（2 2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。洗）。 超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。2021-9-233.原理 SFC的流动相的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；

14、可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC； 分离机理：分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；2021-9-23压力效应： SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）； 超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小； 压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。 CO2流动相，当压力改变：7.09.0106 Pa，则：

15、 C16H34的保留时间 25min 5min。2021-9-23程序升压2021-9-23二、二、超临界流体色谱的结构与流程instrument structure and the general process of SFC1.1.结构流程结构流程 2021-9-232.主要部件（1）SFC的高压泵的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量； （2）SFC的色谱柱和固定相的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱； SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；2021-9-23主要部件（3 3）流动相流动相 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；（4 4）检测器）检测器 可采用液相色谱检