第一章微生物的分离和纯培养hw

1、第一章第一章 微生物培养技术微生物培养技术微生物: 结构都相当简单，个体多数十分微小，通结构都相当简单，个体多数十分微小，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。的甚至没有细胞结构。2 2、类群、类群1 1、特点、特点病毒（无细胞结构、寄生生活）病毒（无细胞结构、寄生生活）细菌细菌 电子显微镜下的结核杆菌电子显微镜下的结核杆菌 放线菌放线菌真菌真菌青霉菌青霉菌酵母菌酵母菌原生生物原生生物病病 毒毒细细 菌菌放线菌放线菌真真 菌菌原生动物原生动物2 2、类群、类群无细胞结构无细胞结构原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞l微生物的分离和纯培

2、养技术是微生微生物的分离和纯培养技术是微生物最基本的实验技术，它包括物最基本的实验技术，它包括培养培养基的制备、灭菌和消毒、接种、培基的制备、灭菌和消毒、接种、培养养等步骤等步骤内容提要：内容提要：微生物及其分类微生物及其分类培养基与各类营养物质培养基与各类营养物质无菌技术无菌技术菌落菌落大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养微生物数量的测定微生物数量的测定1 1、概念、概念二、培养基二、培养基 人们按照微生物对营养物质的人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。营养基质。按成分不同划分按成分不同划分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基化

3、学成分不恒定的天然有机物化学成分不恒定的天然有机物牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基。培养基。用于工业生产用于工业生产化学成分完全了解的物质配化学成分完全了解的物质配制而成的培养基制而成的培养基高氏高氏1 1号培养基、查氏培养号培养基、查氏培养基。基。用于分类和鉴定用于分类和鉴定2 2、分类、分类按物理状态不同划分按物理状态不同划分固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基在液体培养基中加入在液体培养基中加入一定量凝固剂一定量凝固剂，使其成为固体状态，使其成为固体状态，琼脂琼脂含量一般为含量一般为1.5%-2.0%1.5%-2.0%，固体培养基常用来进行，固体培养基常用来

4、进行微生物的微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏种保藏 琼脂含量一般为琼脂含量一般为0.2%-0.7%0.2%-0.7%，观观察微生物的运动特征察微生物的运动特征、分类鉴定、分类鉴定及噬菌体效价滴定及噬菌体效价滴定 不加任何凝固不加任何凝固剂剂，大规模工，大规模工业业生产生产及在实及在实验室进行微生验室进行微生物的基础理论物的基础理论和应用方面的和应用方面的研究研究半固体培养基半固体培养基按用途不同划分按用途不同划分基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的含有一般微生物生长繁殖所需的基本营基本营养物质养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的培

5、养基（牛肉膏蛋白胨培养基）用来将某种或某类微生物从混杂的微用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中生物群体中分离分离出来的培养基，在培出来的培养基，在培养基中加入相应的养基中加入相应的特殊营养物质或化特殊营养物质或化学物质学物质，抑制不需要抑制不需要的微生物的生长，的微生物的生长，有利于所需有利于所需微生物的生长微生物的生长用于用于鉴别不同类型鉴别不同类型微生物的培养基，微生物的培养基，微生物产生某种微生物产生某种代谢产物代谢产物，与培养基与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化应，产生明显的特征变化选择培养基选择培养基3 3、基本营养、

6、基本营养碳源、氮源、能源、生长因子、水、无机盐碳源、氮源、能源、生长因子、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等含含CHONCHON的的有机物有机物是是异养异养型微生物的型微生物的碳源、氮源、能源碳源、氮源、能源(3)(3)能源能源（4 4）生长因子：）生长因子： 微生物生长不可缺少的微量有机物

7、，如：微生物生长不可缺少的微量有机物，如：维生素、氨基酸、碱基等（牛肉膏、酵母膏、维生素、氨基酸、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）。蛋白胨中含有）。 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 应用最广泛和最普通的细菌基础培养基应用最广泛和最普通的细菌基础培养基 培养基组分培养基组分作用琼脂琼脂 20g 20g 牛肉膏牛肉膏 5g5g蛋白胨蛋白胨 10g10gNaCl 5gNaCl 5gH H2 2O O 定容至定容至1000ml1000ml1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方凝固剂凝固剂提供碳源、氮源、能源、生长因子提供碳源、氮源、能源、生长因子碳源、氮源

8、、生长因子碳源、氮源、生长因子无机盐无机盐水、溶剂水、溶剂选择培养基选择培养基应用应用加入加入青霉素青霉素加入加入高浓度食盐高浓度食盐不加氮源不加氮源不加含碳有机物不加含碳有机物的无碳的无碳培养基培养基加入加入青霉素等抗生素青霉素等抗生素延伸：延伸：分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌分离固氮菌分离固氮菌分离自养型微生物分离自养型微生物分离导入了目的基因的分离导入了目的基因的受体细胞受体细胞鉴别培养基鉴别培养基:l加入伊红美蓝琼脂培养基（加入伊红美蓝琼脂培养基（EMS培养基）培养基）l鉴别大肠杆菌鉴别大肠杆菌l现象：蓝紫色金属光泽现象：蓝紫色金属光泽

9、4.培养基要满足微生物对环境条件的需求培养基要满足微生物对环境条件的需求 ：真菌真菌 微酸性（微酸性（5.0-6.05.0-6.0）细菌细菌 中性（中性（6.5-7.56.5-7.5）放线菌放线菌 微碱性（微碱性（7.5-8.57.5-8.5）大多数微生物适宜生长的温度在大多数微生物适宜生长的温度在25-4025-40之间之间厌氧菌需提供无氧条件厌氧菌需提供无氧条件pH：温度：温度：氧气：氧气：1.1.灭菌：灭菌：使用使用强烈强烈的理化因素杀死物体内的理化因素杀死物体内外外所有所有的微生物，包括芽孢和孢子。的微生物，包括芽孢和孢子。三三. .无菌技术：无菌技术： 泛指在培养微生物的操作中，泛指

10、在培养微生物的操作中，防止外来杂菌的污染的方法防止外来杂菌的污染的方法灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌箱干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅2 2、消毒、消毒使用较为使用较为温和温和的物理或化学方法杀的物理或化学方法杀死物体表面或内部的死物体表面或内部的部分部分微生物（微生物（不包不包括芽孢和孢子括芽孢和孢子）。）。煮沸消毒法：煮沸消毒法：100 5-6min巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-75 30min或或80 15min化学药剂消毒法：酒精、氯气化学药剂消毒法：酒精、氯气紫外线消毒：实验前紫外线消毒：实验前30min超净台超净台煮沸煮沸消毒消毒法法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂（化学药剂（70%酒

11、精等）酒精等）紫外线紫外线针对不耐高温的液体针对不耐高温的液体接种室、超净工作台接种室、超净工作台能耐高温的，需要保持干燥的物品能耐高温的，需要保持干燥的物品灼烧法灼烧法干热灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌接种工具（接种环等）接种工具（接种环等）实验操作者的双手实验操作者的双手培养皿等玻璃器皿培养皿等玻璃器皿培养基培养基消毒方法消毒方法灭菌方法灭菌方法实验操作者的衣服实验操作者的衣服单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定义：定义：四、菌落四、菌落鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依

12、据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体五、微生物的分离和纯培养五、微生物的分离和纯培养分散成单个细胞分散成单个细胞, ,形成单个菌落形成单个菌落1 1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（大肠杆菌分离和纯培养）（大肠杆菌分离和纯培养）计算、称量（配制固体培养基要加入琼脂）计算、称量（配制固体培养基要加入琼脂）溶化溶化调调pH(pH(注意：灭菌前调注意：灭菌前调PH)PH)分装、包扎分装、包扎灭菌（高压蒸汽灭菌）灭菌（高压蒸汽灭菌）倒平板倒平板倒平板技术倒平板技术1234使瓶口迅速使瓶口迅速通过火焰通过火焰在火焰旁打开在火焰旁打开锥形瓶锥形瓶打开一条稍

13、大于打开一条稍大于瓶口的缝隙，向培养皿瓶口的缝隙，向培养皿中倒入中倒入 约约10-20ml倒入倒入培养皿，立即盖上皿盖。培养皿，立即盖上皿盖。等待平板冷却凝固等待平板冷却凝固后倒置后倒置 1. 1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？法来估计培养基的温度？ 可以用手触摸盛有培养基的锥可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通为什么需要使锥形

14、瓶的瓶口通过火焰？过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。微生物污染培养基。3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。入培养基，造成污染。 4.4.在倒平板的过程中，如果不小在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部心将培养

15、基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？为什么？ 空气中的微生物可能在皿盖与空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。好不要用这个平板培养微生物。2 2、接种、接种平板划线法平板划线法交叉划线法交叉划线法连续划线法连续划线法1 1、将接种环放在、将接种环放在火焰上灼烧，直火焰上灼烧，直到接种环到接种环_2 2、在、在_旁旁冷却接种环，并冷却接种环，并打开棉塞打开棉塞 3 3、将试管口通过火焰、将试管口通过火焰 4 4、将已、将已_的接种环的接种环伸入菌液中蘸取一环

16、菌液伸入菌液中蘸取一环菌液 6、左手将皿盖打开一条缝隙，右、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，平板内，划划_条平行线，条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。盖上皿盖。注意不要划破培养基。5 5、将试管通过、将试管通过火焰，并塞上棉火焰，并塞上棉塞塞 火焰火焰冷却冷却三至五三至五7 7、灼烧接种环，待其冷却后，、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的从第一区域划线的_开开始往第二区域内划线。重复以始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内上操作，在三、四、五区域内划线。划线。注意不要将最后一区的注意不要将最后一区的划线与第一区

17、相连。划线与第一区相连。末端末端烧红烧红8、将平板、将平板_放入培养放入培养箱中培养。箱中培养。 倒置倒置 为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。可能存在的微生物污染培养物。杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划菌种直接来源于上次划线的末端，从而通

18、过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。环境和感染操作者。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法稀释涂布平板法a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液b.b.涂布平板：涂布平板：滴滴灼灼试试涂涂取取0.1ml0.1ml菌悬液菌悬液微量微量 移液器移液器Pour plate(3)(3)稀释混合平板法（课本

19、稀释混合平板法（课本P14)P14) 将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基，放的培养基，放入入3737恒温箱中恒温箱中倒置倒置培养培养12h-24h,12h-24h,直到长出菌落为直到长出菌落为止。止。3 3、培养、培养4 4、实实验验结结果果观观察察5 5、菌株的保存方、菌株的保存方法法（1）临时保藏：）临时保藏：接种到接种到固体斜面固体斜面培养基，菌培养基，菌落长成后置于落长成后置于44冰箱保存。冰箱保存。（2）长期保存：）长期保存： 甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法搁置斜面搁置斜面六、微生物数量的计算直接计数法直接计数法间接计数法间接计数法（一）直接计数法（一）直

20、接计数法 显微镜直接计数法显微镜直接计数法 将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出体积内的微生物总数。一般适用生物数目来计算出体积内的微生物总数。一般适用于纯培养液悬浮液中单细胞菌体的计数。于纯培养液悬浮液中单细胞菌体的计数。v优点：优点：直观、快速、操作简单直观、快速、操作简单v缺点：缺点：不能区分死菌与活菌，所得为总数，结果往往偏高不能区分死菌与活菌，所得为总数，结果往往偏高不适于对运动细菌的计数不适于对运动细菌的计数需要相对高的细菌浓度需要相对

21、高的细菌浓度个体小的细菌在显微镜下难以观察个体小的细菌在显微镜下难以观察1 1、血球计数板、血球计数板 计数板是一块特制的计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中央平槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一小方格网。其上各刻有一小方格网。 每个方格网共分九个每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为大格，中央的一大格作为计数用，称为计数室。计数用，称为计数室。*#血球计数板计数室有两种刻度血球计数板计数室有两种刻度1大格大格=16中格中格2516=400小格小格1大格大格=25中格中格16 25 =400小格小格 计数

22、室边长为计数室边长为1mm，则计数，则计数区的面积为区的面积为l11 mm2，盖，盖上盖玻片后计数室高度为上盖玻片后计数室高度为0.1mm，所以一个计数室的体，所以一个计数室的体积为积为l0.10.1mm3。(注意：注意：1 ml 1000 mm3 )计数室容积1 1、稀释、稀释 用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液。用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液。2 2、镜检计数室、镜检计数室 加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物，则用自来水冲洗，加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物，则用自来水冲洗，95%95%乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。乙醇棉球轻

23、轻擦洗，然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。3 3、加样、加样 取洁净的血球计数板一块，盖上盖玻片。将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取取洁净的血球计数板一块，盖上盖玻片。将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘滴入一小滴，让菌液利用液体的表面张力充满计数区，少许，沿盖玻片边缘滴入一小滴，让菌液利用液体的表面张力充满计数区，静置静置5min5min。 注：取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生注：取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生2、操作步骤4 4、显微镜计数（以、显微镜计数（以1616小格小格 2525中格的中格的 规格为例）规格为例） 在高倍下在高倍下(40X)(40X)计数对

24、两个计数室记数，方法：每个计数室选计数对两个计数室记数，方法：每个计数室选5 5个中格个中格(4(4个角和中央的一个中格个角和中央的一个中格) )中的菌体进行计数，求得每个中中的菌体进行计数，求得每个中方格的平均值，再乘上方格的平均值，再乘上2525即为大方格中的总菌数，最后换算成即为大方格中的总菌数，最后换算成1ml1ml菌液中的总菌数。菌液中的总菌数。 注：依照注：依照“数上不数下，数左不数右数上不数下，数左不数右“的原则进行计数的原则进行计数 计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体 一般样品稀释度要求每小格内约有一般样品稀释度要求每小

25、格内约有510510个菌体为宜个菌体为宜 计数的结果是两个计数室所记菌数的平均值计数的结果是两个计数室所记菌数的平均值5 5、清洗血球计数板、清洗血球计数板 计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。淀。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。3、计数方法v所统计的中格的总菌数所统计的中格的总菌数A A，菌液的稀释倍数为，菌液的稀释倍数为B B，则，则1ml1ml菌液中：菌液中：

26、 (1) 25(1) 25个中方格的计数板计算公式个中方格的计数板计算公式(2) 162) 16个中方格的计数板计算公式个中方格的计数板计算公式）（个总菌数mlBABA/50000102554）（个总菌数mlBAB/4000010164A4（二）间接计数法（二）间接计数法 稀释平板计数法稀释平板计数法 将待测样品按比例做一系列稀释后，将其中的微生物充分将待测样品按比例做一系列稀释后，将其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定稀释度、一定量的稀释样液接种到平分散成单个细胞，取一定稀释度、一定量的稀释样液接种到平板上，使其均匀分布于平板中的培养基内；或是将一定量的稀板上，使其均匀分布于平板中的培养基

27、内；或是将一定量的稀释液，与溶化后冷却至释液，与溶化后冷却至4545左右的琼脂培养基混合，倾入无菌左右的琼脂培养基混合，倾入无菌培养皿中，摇匀、静置待凝。培养皿中，摇匀、静置待凝。 经过培养，由单个微生物生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，经过培养，由单个微生物生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个菌落代表样品中的一个微生物个体。统计培养基中的出即一个菌落代表样品中的一个微生物个体。统计培养基中的出现的菌落，即可推算出样品中的活菌数。现的菌落，即可推算出样品中的活菌数。l能检测活菌数和杂菌数能检测活菌数和杂菌数l时间长，繁琐，测定值时常受各种因素影响时间长，繁琐，测定值时常受各种因素影响l由于待测样品

28、往往不宜完全分散成单个细胞，所由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成一个单菌落也可能来自样品中的以，长成一个单菌落也可能来自样品中的2-32-3或更或更多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往偏低多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往偏低优缺点：编号编号 稀释菌样稀释菌样 吸取菌样吸取菌样倾注平板倾注平板 恒温培养恒温培养 计数计数1、操作步骤104 105 106原样 101 102 103 104 105 1060.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.2ml0.2ml0.2ml0.5ml0.5ml6支试管，分支试管，分别加入别加入4.5ml无菌水无菌水2、计数原则（1 1）细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有）细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30-30030-300个个菌落为宜，霉菌以每个培养皿内