微生物实验论文-产絮凝剂微生物的筛选

1、环境工程微生物综合实验论文目 录第一部分 产絮凝剂微生物的筛选1一、前言1（一）文献综述1（二）研究目的和意义4（三）研究内容5（四）技术路线5二、材料与方法6（一）材料6（二）方法7三、结果与分析11四、实验体会26第二部分 附加实验28一、革兰氏染色实验28（一）材料与方法28（二）结果与检验28二、饮用水卫生检验30（一）细菌总数的检验30（二）大肠菌群的检验32（三）空气卫生检验35（四）霉菌的分离与观察37第三部分 附录44一、实验设备相关信息44二、参考目录44第一部分 产絮凝剂微生物的筛选一、 前言（一）文献综述1研究背景1.1目前主要的絮凝剂种类絮凝剂又称为沉降剂，作为一类可使

2、液体中不易沉降的固体悬浮微粒（微粒10-310-7cm）凝聚、沉降的物质，在发酵工业后处理、食品加工、木土疏浚施工、废水处理等领域应用广泛1。絮凝剂按照其化学成分总体可分为无机絮凝剂和有机絮凝剂两类。其中无机絮凝剂又包括无机凝聚剂和无机高分子絮凝剂；有机絮凝剂又包括合成有机高分子絮凝剂、天然有机高分子絮凝剂和微生物絮凝剂2。1.2 常用絮凝剂的缺点无机和有机合成高分子絮凝剂的生产和应用虽然已经取得了长足的进步, 但其使用过程中的不安全性和给环境造成的二次污染也引起人们的重视。据有关学者研究表明3, 老年痴呆与现在广泛使用无机絮凝剂聚氯化铝有关。从饮水中摄入体内的铝经过很短的时间即可大量积累于脑

3、组织内, 老年痴呆症患者较之健康人脑组织中含有较多的铝。调查发现, 经常饮用含有较高浓度铝的水的人群中, 老年痴呆症患者人数较多。同时以目前使用较多的聚丙烯酞胺为例, 虽然完全聚合的聚丙烯酞胺没有多大问题, 但其聚合单体丙烯酞胺却具有强烈的神经毒性, 并且还是强的致癌剂, 所以聚合过程中单体的残留是一个令人十分担忧的问题。关于丙烯酞胺的危险性的报告已不胜枚举。此外化学絮凝剂共同的缺点是产生的絮体较脆弱，在水中受到搅动时容易破碎，并且沉降速度较小，采用硫酸铝，在快速絮凝沉降中，絮体的沉降速度仅有2.43.6mh-1，其更大的缺点是产生的污泥难于进行浓缩和脱水，因而污泥处理的费用就比较高4。因此开

4、发一种安全的、可生物降解的、对环境和人类健康无害的新型水处理剂迫在眉睫。微生物絮凝剂因其高效、无毒而成为国内外近年来的研究热点课题。2发展现状2.1微生物絮凝剂的发展历史尽管在20世纪50年代，人们就发现了能产生絮凝作用的细菌培养液，但真正深入的研究却始于1976年，J.Naknmura等对能生产絮凝效果的微生物进行了研究。从霉菌、酵母菌、细菌、放线菌等214种菌株中筛选出19种具有絮凝能力的微生物。研究较为深入的是Aspergillus Sojae AJ7002产生的絮凝剂，由此掀起了微生物絮凝剂的研究热潮。1985年，H.Takagi等人研究出了PF101微生物絮凝剂，主要成分是半乳糖胺。

5、它对枯草杆菌，大肠杆菌，啤酒酵母等均有良好的絮凝效果。1986年，Ryuichiro Kurane等人，采用从自然界分离出的红球菌属微生物Rhodococcus erythropolis的S-1菌株，制成絮凝剂NOC-1。并且把它用于畜产废水处理，膨胀污泥处理，砖场生产废水处理，还有废水的脱色处理，都取得了很好的处理效果，被认为是目前发现的最好的微生物絮凝剂。在此之后的研究中，比较有代表性的是1997年Suh.H.-H.等人发现的DP-152絮凝剂，因其是首次发现杆状细菌也能产生絮凝剂。我国对微生物絮凝剂的研究起步较晚，除台湾省的邓德丰等人5，从废水处理场的废水中分离到C-62细菌菌株产生的微

6、生物絮凝剂；中科院成都研究所张本兰从活性污泥中分离得到的P.alcaligenes8724菌株产生的絮凝剂和武汉市建设学院康建雄、陶涛用黑酵母以淀粉水解或葡萄糖为原料发酵产生的普鲁兰絮凝剂外，2001年邓述波等人从土壤中分离筛选得到硅酸盐芽孢杆菌新变种，该菌产生絮凝剂MBFA9，并把该絮凝剂用于给水处理中，以河水作为絮凝对象，出水浊度降至0.8NTU。但这些研究只停留在实验室研究阶段，并未见工业应用的报道。近年来, 国外对微生物絮凝剂作了大量的研究, 筛选得到了几十种微生物絮凝剂, 如Bacillussp. I - 450 (C. GaneshKumar et al. , 2004)、Cory

7、nebacter ium g lutam icum (NingHe et al. , 2002)、Baillus firmu (H. Sa lehizadeh et al. , 2002)等。其中最具代表性的MBF是Kurane利用红平红球菌(R hodococcus erythropolis)研制成功的微生物絮凝剂NOC-1对泥浆水、河水、粉煤灰水、膨胀污泥、纸浆废水等均有极好的絮凝和脱色效果(Kurane R et al. , 1986)，是目前唯一工业化应用的MBF。目前微生物絮凝剂研究面临的主要问题是新型微生物絮凝剂产生菌的筛选、培养成本的降低、提高絮凝活性和降低絮凝剂用量。2.2微生

8、物絮凝剂的种类和来源从微生物絮凝剂来源看，其种类主要分为四种：直接利用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母菌，它们大量存在于土壤、活性污泥和沉积物中；利用微生物细胞壁成分的絮凝剂，如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和N乙酞葡萄糖胺等成分均可用作絮凝剂；利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂，微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物主要是细菌的荚膜和粘液质，除水分外，其主要成分为多糖及少量的多肽、蛋白质、脂类及其复合物，其中多糖和蛋白质在某种程度上可用作絮凝剂；通过克隆技术获得的絮凝剂。若以微生物絮凝剂的化学组成作为分类标准，则又可分为蛋白质类、多糖类和脂类。由于微生物絮凝剂种类繁多，因此其结

9、构性质差异较大。本实验是采用第一种方法，通过检验出微生物中是否有絮凝剂的产生来筛选产絮凝菌。2.3微生物絮凝剂的优点与局限性据马放等的研究显示6，微生物絮凝剂为微生物菌体或菌体外分泌的生物高分子物质，属于天然有机高分子絮凝剂，它安全无毒，这已被许多实验证明；目前的除油方法主要集中于生物除油，一般的化学絮凝剂在不同程度上，抑制微生物降解作用的发挥。而微生物絮凝剂则不同，它不但具备絮凝作用，且有降解性能，可提高油的去除效果。微生物絮凝剂对废水的脱色效果也很显著；微生物絮凝剂为微生物菌体或有机高分子，应较化学絮凝剂便宜。微生物絮凝剂是靠生物发酵产生的，化学絮凝剂是人工合成的。从生产所用原材料，生产工

10、艺能源消耗等方面考虑，微生物絮凝剂处理技术总费用较化学絮凝处理技术总费用低。一般工业废水采用生物处理的技术费用低于化学处理技术的处理费用， 采用微生物絮凝剂处理废水，前面以生物吸附为主，后面以生物降解为主，其过程类似于AB法，其处理费用较目前的化学絮凝处理费用低，大约节约1/3的资金。除此之外，微生物絮凝剂还应用于其他方面，如去除畜产废水有机物7，畜产废水是比较难处理的废水之一，不但带有很大的气味，主要的是还有高浓度的总碳和氮。NOC-1对猪粪废水具有很好的效果，处理后的上清液几乎透明，能有效地去除总碳和氮，并已经很好地应用于实际当中。利用微生物絮凝剂对锦鲤养殖中的污水进行净化处理，经净化后，

11、测定水体中的污染物指标，总氮减少66.3，总磷减少71.5，COD减少69.2，透光率增加313.68。微生物絮凝剂对废水中的COD和BOD具有很好的处理效果。王琴等研制的复合型生物絮凝剂(CBF)通过与化学絮凝剂复配其对松花江水的COD去除率达到91.29。据马放等研究综合表明10，微生物絮凝剂以其无可比拟的优越性彰显了广阔的发展前景，但到目前为止，相比于其他类型的絮凝剂，微生物絮凝剂在实际工程中尚未得到广泛应用。通过上述研究现状的分析，国内外微生物絮凝剂的研究还存在很多问题：首先，微生物絮凝剂虽然种类繁多，但每种絮凝剂的应用范围较窄，无法实现处理对象的广泛性沉淀和降解；其次，微生物絮凝剂产

12、品使用量巨大，但产量低、稳定性差、不易储存，增加了工业化生产的难度；第三，生产成本高，微生物絮凝剂的高制备成本限制了其大规模生产，成为制约微生物絮凝剂发展的关键因素，寻找廉价的可替代原料是解决这一问题的有效手段；第四，针对微生物絮凝剂的复配研究仍处于初级阶段，复配手段不成熟，产品运行不稳定。现阶段对于解决微生物絮凝剂存在的瓶颈问题，已经取得一些显著成果。如利用微生物工程、代谢工程和遗传工程，大幅度提高微生物絮凝剂产生菌的产絮能力；寻找廉价的原材料，以大幅度降低生产成本等。（二）研究目的和意义微生物絮凝剂是由微生物产生的具有絮凝活性的代谢产物，它能使反应体系中的胶体和悬浮颗粒物相互聚集，形成絮体

13、沉淀，并从体系中分离出来11。可现今普遍应用的化学絮凝剂，特别是无机絮凝剂聚氯化铝对老年痴呆症的病发有一定的影响12，同时能诱发“致畸、致癌、致突变”三致作用13，对人们产生不良影响。以目前使用较多的聚丙烯酞胺为例, 虽然完全聚合的聚丙烯酞胺没有多大问题, 但其聚合单体丙烯酞胺却具有强烈的神经毒性, 并且还是强的致癌剂, 所以聚合过程中单体的残留是一个令人十分担忧的问题。此外化学絮凝剂共同的缺点是产生的絮体较脆弱，在水中受到搅动时容易破碎，并且沉降速度较小，采用硫酸铝，在快速絮凝沉降中，絮体的沉降速度仅有2.43.6mh-1，其更大的缺点是产生的污泥难于进行浓缩和脱水，因而污泥处理的费用就比较

14、高14。微生物絮凝剂为微生物菌体或菌体外分泌的生物高分子物质，属于天然有机高分子絮凝剂，它安全无毒、高效成为近年来研究的热点课题。筛选出能产絮凝剂菌，同时对其各项性能进行研究，应用于发酵工业后处理、食品加工业、土木疏浚施工、废水处理等领域，能有效防止因絮凝剂的使用所造成的环境污染、降低处理成本，利于人类生存与健康。（三）研究内容本研究作为学生自主性学习基础研究，研究目的是拟筛选出新型高效能产絮凝剂微生物，并对其相关性能进行研究。目前水污染所用的高质量活性污泥主要是在厌氧处理阶段产生，在厌氧污泥中更容易筛选得到絮凝活性高的菌株。因此本课题选用厌氧污泥污水作为原始样品，通过分离等过程，优化培养条件

15、，研究絮凝特性，为生物絮凝剂的规模化生产提供理论基础。其主要研究内容有：（1）本实验通过常规细菌分离方法，利用肉膏蛋白胨琼脂培养基对污水中的微生物进行分离，分离出“潜在”产絮凝剂的各类细菌。（2）选择不同形态、颜色的细菌菌落在发酵培养基中进行发酵培养后，分别对其进行产絮凝剂菌筛选，利用高岭土悬浊液和氯化钙溶液的混合液，对通过发酵培养的菌株进行能产絮凝剂菌的初筛选，初步得到絮凝活性菌株后再通过分光光度法等确定菌发酵液的絮凝程度。（3）通过对细菌菌落的特征、个体形态等的观察，为进一步的菌株鉴定打下基础。（4）对目的菌株进行合成絮凝剂的培养基和培养条件进行优化。（5）对目的菌株所产微生物絮凝剂菌进行

16、性能研究，并总结微生物产絮凝剂和絮凝性的规律。（四）技术路线 为让读者更深刻了解本研究的过程，实验的技术过程如下图1所示。 图1 本实验的技术路线简图二、 材料与方法（一）材料1.1实验仪器培养皿（直径9cm）4套、移液管（10毫升、1毫升）、三角瓶（250毫升、150毫升、50毫升）、烧杯、量筒（100毫升）、漏斗、漏斗架；牛皮纸（或报纸）、纱布、棉花；玻璃珠、蒸馏水（配培养基用）酒精灯、接种环、载玻片、擦镜纸1.2实验设备实验设备见下表1所示。名称型号（品牌）恒温培养振荡器HNY电热恒温隔水式培养箱SGSP-02电冰箱Casarte电子显微镜ML11立式压力蒸汽灭菌器LS-50L电炉1.3

17、实验药品培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；分离培养基：营养琼脂培养基；筛选培养基（发酵培养基g/L）：葡萄糖20 g， KH2PO4 2g，K2HPO4 5g， (NH4) 2SO4 0.2g，NaCl 0.1g，尿素0.5g，酵母膏0.5g稀释水：无菌水香柏油、二甲苯、斜面培养基；4g/L高岭土悬浊液；5mL1%(wt %)CaCl2；（二）方法2.1样品的采集用无菌三角瓶取一定量的有代表性的活性污泥或生物膜样品，立即送实验室检测。若不能马上处理，必须存入冰箱，但不得超过12h；本次实验样品来自某厌氧污泥池的污水。2.2实验材料的准备2.2.1器皿包装2.2.1.1培养皿包装用牛皮纸或旧报纸进

18、行包装。包好后灭菌备用。2.2.1.2吸管的包装在已干燥的吸管的平头端距0.5cm处，塞长约1.5cm的棉花，松紧要合适。过松，棉花易脱出；过紧，吹吸费力，甚至吹吸不动。棉花的作用是防止吸管中的细菌吸入口中，同时又防止口中的细菌吹入管中。将塞好棉花的吸管的尖端，放在裁成4cm 5cm宽的长报纸条的一端，吸管与纸条约成45角。折叠纸角，包住吸管尖端，然后以螺旋式在桌面上用力向前搓转，纸条将吸管包紧，余下的纸尾打成结。将这样包好的几根或几十根吸管放一起，再用一张牛皮纸或两张报纸包装，然后干热灭菌。2.2.1.3三角瓶的包装在三角瓶的瓶口上塞上合适大小的瓶塞（棉塞或泡膜塑料塞），在瓶口外面包上2层至

19、 3层报纸，扎好灭菌。若进行湿热灭菌，最好再包一层牛皮纸或铝铂，以免打湿棉塞。2.2.2无菌水的制备在150mL三角瓶中加90mL蒸馏水，放20粒 40粒玻璃珠（用以打碎污泥颗粒，使其中的微生物游离出来），塞上硅胶塞，包扎好，灭菌备用。2.2.3培养基的制备2.2.3.1制备培养基的过程及要求配制 取一合适的干净烧杯，先加入一定量的蒸馏水，按培养基的配方依次称取各种成分，并依次加入蒸馏水中。在有石棉网的电炉上加热，用玻璃棒不断地搅动，待药品全部溶解后，补加蒸馏水至所配体积。若配制固体培养基，将琼脂加入继续搅拌，以防糊底。分装 将配好的培养基分装于三角烧瓶中。分装时培养基不能滴到瓶口上，以防瓶塞

20、被污染。分装量视需要及容器大小而定。液体培养基的高度为容器高度的1/41/3。2.2.3.2肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备按说明称取一定量的营养琼脂培养基于250毫升三角瓶中，根据进行配制，趁热分装，塞好棉塞，包上牛皮纸，扎好，灭菌。2.2.4高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌法是利用高压蒸汽锅进行灭菌的方法。高压蒸汽灭菌锅有自控式和非自控式两类。实验室通常采用的是非自控式高压蒸汽灭菌锅。非自控式高压蒸汽灭菌锅又分为手提式和卧式两种，其结构和基本原理相同。压力锅上主要有压力表、加水口、排水口、安全阀、放气阀等；热源有电炉、煤气或蒸汽。2.3菌种的分离2.3.1样品处理取20g （或适量）样品放入内有玻璃珠的

21、无菌水中，振荡20min，将团粒打碎。2.3.2样品稀释利用经高温蒸汽灭菌1mL移液管吸取1mL经处理的水样，以无菌操作（在点燃的酒精灯旁操作）加入到9mL 无菌水（内有玻璃珠）中，通过移液管的上下吸取液体进行振荡、摇匀，浓度即为10-1的菌液。浓度梯度为10-2、10-3等的菌液制取步骤与上述一致。具体操作见下图2所示。图2 样品稀释度步骤示意图2.3.2倒平板将培养皿编号。在无菌条件下，先用1支1mL 移液管吸相应浓度梯度的1mL菌液注入已编号的培养皿中。每个培养皿中加入已融化且冷却至45C左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（注意：温度过高易将细菌烫死；过低易凝固），迅速轻轻地在平面上转动，使培

22、养基与稀释液混匀（注意：不能沾到培养皿内壁上或溢出皿外）。冷却后，30C恒温条件下，在隔水式培养箱中倒置培养48h，取出，放于冰箱停止培养，为后续实验备用。2.4菌种的筛选2.4.1 筛选方法用接种环将上述实验分离到的菌种接种到装有40ml发酵培养液的200ml三角瓶中进行预发酵培养,温度设定为30，在恒温摇床中进行培养。摇床转速为160r/min，1824h后，按2.5 %的接种量将预发酵培养液接种到发酵培养基中进行发酵培养72h（温度和摇床转速与预发酵同）。通过测定各培养液的絮凝率进行初筛，对初筛获得的菌进行平行发酵培养，将絮凝率较高且稳定性较好的菌株作为复筛菌种。筛菌的模型如下：样品采集

23、稀释富集培养平板划线挑菌落纯化培养富集培养复筛高效絮凝剂产生菌。2.4.2絮凝剂样品的制备将发酵液于12000r/min 离心10min，取上清液作为絮凝剂样品。2.4.3初筛在100mL量筒中加入93mL 4g/L高岭土悬浊液，5mL1%(wt%)CaCl2，2mL培养液，将量筒颠倒35次。目测，使高岭土悬浊液絮凝成较大絮状体的为有絮凝活性的菌株。2.4.4复筛与絮凝率的测定在100mL量筒中加入80mL蒸馏水，0.4g高岭土，5mL1%的CaCl2溶液，2mL絮凝剂样品，然后加蒸馏水至100mL，调节pH 至7.0，溶液倒入150mL烧杯中，放在磁力搅拌器上快速搅拌1min，慢速搅拌3mi

24、n，静置3min，用吸管吸取一定深度的液层于722型分光光度计550nm处测定吸光度，以不加发酵液的吸光度为对照来确定菌发酵液的絮凝程度。絮凝率=(A-B)/A100%式中， A对照上清液550 nm 处的吸光度；B样品上清液550 nm 处的吸光度。 测定了个菌株发酵液的絮凝率后，将20mL筛选培养基装入50mL三角瓶中,接种自分离平板上纯化出的菌株。140r/min，30摇床培养72h ，将所得培养液进行絮凝活性的初步测定。以通用发酵培养基为基础，分别改变培养基中的碳源、氮源种类，碳源、氮源浓度以及初始pH值和培养温度，进行发酵培养，通过絮凝率的大小比较来确定最佳培养条件。三、 结果与分析

25、3.1菌种分离3.1.1结果描述实验中对污水菌种的分离共设置了六个稀释度，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5以及10-6，将10-3、10-4、10-5以及10-6稀释度的污水进行倒平板，在30C恒温条件下，于隔水式培养箱倒置培养48h后，取出。对分离后的细菌进行菌落形态、特征等观察，其结果如下：稀释度为10-3的平板：总菌落数为57，分布平均。大部分菌落表面光滑，仅有一菌落表面干皱。颜色为米白色，其中有一小部分（56个）略显黄色。菌落边缘的小斑呈光滑圆形，大斑则呈云朵状。菌落的最大直径约为1cm，最小仅为0.1cm。如下图3所示。图3 稀释度为10-3的平板的菌落图稀释度

26、为10-4的平板：总菌落数为37，大菌落分布较靠近平板边缘，总体上分布较为平均。总体上各菌落的直径分布在23mm，呈米白色。极少部分（12个）直径超过5mm。同时，较大菌落表面干皱起毛，边缘为波浪形。而深黄色的小菌落表面光滑凸起。如图4所示。图4 稀释度为10-4的平板的菌落图稀释度为10-5的平板：总菌落数为14个，零散分布，且尺寸较小（几乎为白色小点），多分布在平板边缘地方。总体颜色为乳白色，菌落表面光滑且大菌落有明显的凸起，小菌落凸起不明显。如图5所示。图5 稀释度为10-5的平板的菌落图稀释度为10-6的平板：总菌落数仅为3，且分布多位偏边缘。其中一个呈黄色，表面光滑凸起，直径约为3m

27、m；另一个则呈白色，表面光滑但平坦，直径约为1.5mm；而最后一个则呈浅白色，表面略干皱，直径约为1.5mm。如图6所示。图6 稀释度为10-6的平板的菌落图3.1.2结果分析从上述结果可知，菌落数随稀释度的增大而减小，符合一般规律。从稀释角度看，稀释度为10-3以及10-4的培养基，菌落数落在区间30300，说明稀释度选择较好；而对于稀释度为10-5和10-6的培养基而言，菌落数分别为14和3，并不在30300的区间内，说明稀释度选择不合适。但从实验结果来看，也可以作为有效结果作为结果分析。从总体上看，绝大部分菌落表面光滑且呈米白色（或乳白色），菌落边缘不平齐，大小不一（由于没有深入研究该类

28、型细菌的性能等，故无法得知该类型细菌是何种细菌，后文称之为A细菌）。由此可以推断，污水中的微生物经培养基分离培养后，A细菌处于优势地位，在生物资源的抢夺上具有优势。对于稀释梯度小的培养基而言，A细菌显示出群体优势，可能是由于在细菌个数较多的条件下，A细菌之间能发出某种信息，形成互生关系等彼此有利的生物关系，从而能在各种细菌的竞争中脱颖而出。但对于高稀释度的培养基而言，相对来说，A细菌的个体数目变少，群体优势难以发挥，所以时有其他类型的细菌出现。实验中，由于个人操作原因影响，经与其他组别的对比可知，倒平板后的摇匀操作对细菌的均匀分布影响深远。若力度过小，则在培养48h后，大都会出现细菌扎堆生长的

29、情况，导致后续步骤，如计数、选菌等，难以开展。由于细菌扎堆生长，无法断定该菌落是否由一个纯种细菌生长繁殖而来，故同时影响后续的筛选步骤。在理解了倒平板后摇匀的原理后，我小组适当摇匀，力度把握适中，既没有让培养液外溅，同时也能保证细菌能较好分布均匀，所形成的菌落可以判断大多是由一个纯种菌生长繁殖而来的。实验中个别组在培养基完全冷却后，培养基底部出现凹凸不平的现象，究其原因，主要是因为在摇匀培养基时过分左右摇动，部分培养基在以凝结的情况下，由于在外力的作用下，被强制移位，使其成固体状整体迁移，容易造成凹凸不平，极大地影响了细菌的生长繁殖。实验中，经稀释的细菌利用移液管移样至培养皿过程中，应从高稀释

30、梯度到低稀释梯度依次进行，这样做的原因主要是二：（1）节省了移液管的使用数目；（2）对下一个稀释梯度的菌个数没有直接影响。而针对第二个原因的提出，对其解释为，高稀释梯度的细菌液低一级稀释度的细菌液相比，细菌数目是几何级的减少，上述实验中，10-6稀释梯度培养基有3个菌落，而10-5稀释度培养基则有14个菌落，也就是说，在10mL的细菌液中，10-6稀释度试管中仅有约30个细菌，而10-5稀释度的试管中却有140个细菌，二者相差近5倍。且对于越低稀释倍数，其相差越大，因此，用同一支移液管依次从高稀释梯度到低稀释梯度吸取菌液，对最后的菌落数几乎没有影响。值得提出的是，实验中是对样品进行体积取样的，

31、因体积对温度的差异较敏感，样品密度差异、量器上的黏附，有可能差生较大的取样误差，此外，人为读数误差也会影响结果。3.2菌种的筛选3.2.1发酵培养实验中，根据各稀释度培养基菌落的分布情况，选取菌落分布均匀且无与其他菌落“并连”生长的菌落，以确保所接种的菌落是由单一纯种细菌生长繁殖而来。分别将稀释度为10-6培养基中的一个菌落（如图7所示）、稀释度为10-4培养基中的两个菌落（如图8所示）接种到发酵培养液中（将所选菌落依次编号为SK1KS、SK2KS、SK3KS），于恒温30C的摇床培养48h（具体培养方法见2.4），后取出进行菌种筛选实验。SK1KS图7 稀释度为10-6的接种菌落SK3KSS

32、K2KS图8 稀释度为10-4的接种菌落实验中，经发酵培养后三个菌落菌株的发酵结果如下图911所示。SK1KS菌株以及SK3KS菌株均能看到明显的黄白色絮状物产生，且培养液透明度较高。而SK2KS没有明显的絮状物产生，培养液呈现浑浊状态。从菌落形态特征分析，SK1KS和SK3KS菌株从外形、形态上均有相似的地方，且菌落大小几乎一致，可以初步断定这两种菌很有可能是同一种菌。而对于SK2KS而言，该菌落表面粗糙干皱，菌落较大，呈灰白色，明显与前述两种菌不是统一类菌种。由此可见，对于同一菌种而言，经发酵培养后，所产生的代谢物或产物自然一致；反之，不同菌的发酵培养结果自然不一样。此外，发酵培养同时也是

33、细菌的增殖生长过程。SK1KS和SK3KS可能都是一种具有荚膜的细菌，在细菌的生长繁殖过程中，细菌利用营养物质的同时，会分泌粘性物质，从而相互聚集，形成菌胶团，当细菌生长到一定程度时，便会形成肉眼所见的絮状物。该机理可能与活性污泥中微生物的相互黏附有一定相似的地方，只是由于该菌株是纯菌，所以形成的絮状物颜色为黄白色，与菌落颜色几乎一致；而由于活性污泥是由各种各样的微生物聚集而成的，其生物的多样性决定其聚集后的颜色显现为深褐色。图9 SK1KS菌落菌株发酵结果图10 SK2KS菌落菌株发酵结果图11 SK3KS菌落菌株发酵结果对于SK2KS菌株而言，该类细菌可能不具有荚膜结构，无法形成菌胶团，发

34、酵培养过程只是简单的分泌特定物质与自身生长繁殖过程，所以其发酵培养液呈浑浊状态。浑浊的发酵液表明细菌在发酵液中经过繁殖，产生了大量后代。值得提出的是，发酵培养所用三角瓶的瓶塞是硅胶塞，在发酵培养过程中利于空气中氧气的进入，供细菌发酵、繁殖。由此可见，该发酵为好氧发酵。此外，在摇床中振荡培养目的是为了使细菌与培养液充分接触，加快其生长繁殖。3.2.2菌种的初筛实验中，取上述经发酵培养的细菌培养液2mL于100mL中，进行初筛试验（具体方法见2.4.3）。实验结果如下图1213所示（由于SK3KS菌株经发酵培养后的初筛结果于SK1KS的一致，故实验中没有对其结果进行拍照）。从图1213可以看出，实

35、验中均没有筛选出具有产絮凝剂功能的细菌。若有筛选可产絮凝剂菌，其现象相应为：在倾倒35次后，在两到三秒内，能看到使高岭土悬浊液絮凝成较大絮状体，产生界面并迅速下降。但实验中并没有出现该现象。图12 SK1KS菌株发酵后的初筛结果图13 SK2KS菌株发酵后的初筛结果综上，本实验并没有筛选出能产絮凝剂的细菌，故后续的复筛以及性能研究实验不能开展。在进行初筛实验时，注意在取培养液时要无菌操作（即利用经高温蒸汽灭菌的移液管量取2mL培养液），若带菌操作，当后续初筛现象出现絮凝现象，则无法利用培养液中的絮凝菌，因其在外部带菌操作下，无法证明培养液中的是纯种单一菌落。由于实验中常温直接对污水的稀释样进行

36、取样培养，分离出的细菌有可能含杆菌、球菌、螺旋菌等菌种，为进一步收缩筛选范围，二次实验仅对芽孢菌进行筛选且方法与细菌分离筛选方法一致，故在此不再赟述。3.3芽孢菌分离对污水水样进行8085C的高温处理后，污水中大部分微生物均已死亡，仅剩耐高温的芽孢菌，此时对经高温处理的水样按2.3.2样品稀释办法进行稀释，稀释度分别为：10-2、10-3、10-4.在上述稀释度水样各取1mL进行倒平板（培养基与上文提及培养基一致），在30C恒温条件下，于隔水式培养箱倒置培养48h后，取出。对分离后的芽孢菌进行菌落形态、特征等观察，其结果如下：稀释度为10-2的平板：菌落分布平均且密集，无法准确数清菌落数。大部

37、分菌落表面光滑，呈灰白色；菌落边缘似有辐射状，往外伸展。菌落形态较一致，故可以判断实验过程中并没有受到杂菌污染。 见下图14所示。图14 稀释度为10-2的平板的芽孢菌菌落图稀释度为10-3的平板：菌落分布较均匀，总菌落数约为88。大部分菌落表面光滑，呈灰白色；菌落边缘似有辐射状，往外伸展。菌落形态较一致，故可以判断实验过程中并没有受到杂菌污染。该稀释度培养的芽孢菌形态特征与10-2较相似，可以判断二者应该为同一种菌。见下图15所示。图15 稀释度为10-3的平板的芽孢菌菌落图稀释度为10-4的平板：算上小型菌落，共有菌落12个。其中一个发展成块状，大小为4.32.3cm，靠边生长，并呈丝状发

38、散生长。其他分布较分散，形态特征与上述类似，在此不再赟述。图16 稀释度为10-4的平板的芽孢菌菌落图从上述实验结果可以发现，实验中分离出的芽孢菌很有可能为同一种芽孢菌，而根据图16的实验结果图可以知道，本实验中分离出的芽孢菌生长到已经阶段后，呈小而轻，且以丝状发散，形态与丝状菌相类似。颜色为灰白色。从上述实验结果图片可以看出，随着稀释梯度的增大，菌落数目逐步减小，可见实验结果符合一般规律，可用于一般性分析。上述个别芽孢菌落较小，可能原因主要有以下：（1）从图1416可以看出，大菌落一般都靠边生长，培养基中间位置一般生长小菌落，由此可以知道，在倒平板时没有把培养基摇均匀，或持续的摇动中（摇动过

39、程中还是液态的培养基呈旋风状）使营养物质中间分布少而外围分布多，导致芽孢菌靠边生长优势更大，形成菌落更大；（2）同一类群由于个体差异，导致其即使在同一生长环境，也存在不同的生长结果。实验中，在将稀释水样移取到培养皿中后，可以不必等待培养基处于不烫手（但仍没有凝结），因实验要分离的是芽孢菌，其可耐高温，故即使培养基仍处于6070C的高温，也可直接进行倒平板，而对水样中的菌没有影响，可大大节省实验时间。经培养后的芽孢菌，以上述对细菌的筛选方法对其进行筛选。如下图1617所示，为所选取进行发酵培养的菌落。图17为菌落，取自稀释度为10-4的培养基中，其直径约为1cm，米白色，边缘圆滑且表面光滑，不透

40、明，质地看起来较软；图18为菌落，取自稀释度为10-3的培养基中，其直径约为1.2cm，米白色，边缘圆滑，不透明，且质地看起来较软。（为增大实验的可靠性，故本小组在对菌进行发酵培养时，特选取两个稀释不同的菌落进行相关实验，由于稀释度为10-2的培养基，菌落生长过于密集，无法判断其是否由一个菌生长而来，故不对该培养基的菌进行发酵培养）。发酵培养结果见下图1920所示。图17 稀释度为10-4的接种菌落图18 稀释度为10-3的接种菌落芽孢菌菌落图19 芽孢菌菌落菌株发酵结果芽孢菌菌落图20 芽孢菌菌落菌株发酵结果实验中，取上述经发酵培养的细菌培养液2mL于100mL中，进行初筛试验（具体方法见2

41、.4.3）。实验结果如下图2122所示。从图2122可以看出，实验中均没有筛选出具有产絮凝剂功能的细菌。若有筛选可产絮凝剂菌，其现象相应为：在倾倒35次后，在两到三秒内，能看到使高岭土悬浊液絮凝成较大絮状体，产生界面并迅速下降。但实验中并没有出现该现象。图21 芽孢菌菌株发酵后的初筛结果图22 芽孢菌菌株发酵后的初筛结果综上，二次实验仍然没有筛选出能产絮凝剂的细菌。四、 实验体会本实验，通过两成员的合作，完成了关于产絮凝剂微生物的筛选实验。实验中，通过对污水中的微生物进行分离、筛选等步骤，对产絮凝剂微生物进行筛选，并将对筛选得到的微生物进行相关的性能研究，以期了解、掌握产絮凝剂微生物的最优生长

42、条件、最优筛选条件等，为生物技术领域对微生物絮凝剂的生产、优化产业链提供理论基础。由于通过两个分离、筛选实验后，仍没有筛选出能产絮凝剂微生物，故无法对产絮凝剂微生物进行有效的性能研究实验。科学研究过程中，或说是不断的试验中，总会遇到这样或那样的失败，就像人生中的每个过程，也会遇到大大小小的磕磕碰碰。本实验虽然无法如预料中筛选出能产絮凝剂的微生物，无法对其性能进行进一步的研究，达到预期目的。可是，实验过程中不就是一个不断学习的机会吗？从最初的包装仪器灭菌到培养基、平板的制作；从菌落形态的观察、菌落的计数到选菌进行发酵培养等，我们学习到的不仅仅是动手实验、操作能力，更多的是如果通过自己的思考、分析

43、，对实验中遇到的问题或对实验的创新，提出行之有效的实验方法。微生物实验课，更多的注重学生各方面能力的培养：仪器包装灭菌培养的是学生的细致与动手能力；无菌操作培养的是学生的耐心与专注能力；选菌发酵培养所培养的却是学生的分析能力；而最后关于实验论文的撰写则是对学生各方面能力的总结与提升。很多时候，我们都强调一点的是，过程比结果重要。或许这一句话在本实验中体现得淋漓尽致。虽然实验中得不到预期结果，可是实验穿插了大小总四个附加实验，以对学生的能力进行全方位的培养与提升。附加实验更多的是实用性实验，如自来水大肠杆菌的检测、空气菌落的检测等，不正是与我们的生活息息相关么？实验除了满足科学研究，对未来可能的

44、大范围应用提供理论依据外，还应该满足现今真切需要，而现今的雾霾天、饮用水安全已经越来越成为人们关注的热点问题，对饮用水、空气的检测正是很好地满足了现今急切的需要。虽然这些附加实验中的大多实验步骤与“产絮凝剂微生物的筛选”实验雷同，可是二者的侧重点有明显不同。单是上述的列举由足以说明。本实验中，成员组的两个成员进行了有效的交流与合作。从实验前的预习到实验操作；从实验中的仪器准备到实验现象的记录、总结与分析，到最后实验论文报告的撰写，均由彼此协作完成。具体为，一方搜索文献等相关资料的同时，另一方进行有效的资料筛选；一方进行实验操作的同时，另一方在旁引导以及协助；一方进行实验思考与分析的同时，另一方

45、在完善相关基础资料，如综述、实验材料记录等。概括来说，成员组没有出现偷懒与得过且过现象，我们二人协作紧密且分工明确。盖棺定论，微生物实验在进行的近十周时间里，得到的远比想象的多。在此之前，实验给我们的感觉从来是枯燥与乏味的，因为我们得不到也没有尝试过思考与分析。从来是一个实验的完结同时也是该画上句号的时刻。但本次实验却以创新性的实验论文形式，促使我们对实验前、实验中、实验后，有所思、有所辨、有所析，大大提高了我们对该实验的投入度与积极性。尽管我们得不到我们想要的结果，也尽管在实验过程中对所预设的结果充满期待，一度期盼声充斥着实验室，也尽管实验结果永远是理性的，但我们的个人却可以感性的，过程不重

46、要，只要我们每个人都对实验过程行以有实在性的总结、有思辨性的分析，并从中得益，或许对于我们来说，这已经是比得到预设结果更有利的收获了，愿我们带着这份心认真地对待人生中的每件事。第二部分 附加实验一、 革兰氏染色实验（一）材料与方法1.1材料实验器材：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等；实验试剂：美蓝染液、结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红花红染液、分离的菌种等。1.2 方法涂片：在干净的载玻片中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧灼，冷却后，以无菌操作，挑取少量菌种于载玻片水滴中，或用吸管直接滴一滴活性污泥悬液于载玻片上，混匀并涂成薄膜，注意涂布面积不要太大。干

47、燥：自然干燥。固定：将已干燥的涂片正面朝上，于火焰顶上迅速通过2次3次，使其蛋白质凝固，以固定细菌外形，并使其不易脱落。但切记直接在火上烧玻片，以防菌体变形。染色：在涂片薄膜上滴加染液（美蓝或结晶紫）1min2min。水洗：倾斜载玻片，打开水龙头，用细水流冲洗（最好沿载玻片对角线冲洗），直至冲洗水无色为止。镜检：用吸水纸轻轻地将涂片边缘的水珠吸掉，凉干后于显微镜下观察，先使用10倍物镜观察找到菌，然后使用40倍物镜观察菌落染色情况，并绘图或拍照。（二）结果与检验染色和显微镜观察选取了两个菌落的菌体，而两个菌落分别来自分离浓度为10-3和10-4的固体培养基。具体观察结果如下：1.培养基浓度为1

48、0-3的菌种染色观察记录1.1选取菌落特征：菌斑直径大约为1.2cm，菌种颜色呈米白色，边缘圆滑，表面光滑，质地较软，透明度较低。该菌斑相较其他菌斑面积较大，说明细菌繁荣较为良好。1.2染色显微镜观察结果图1 培养基浓度为10-3的菌种染色结果（拍摄自目镜）由于在涂片操作中，用接种环挑取的菌种体积较大（约芝麻大小），所以染色操作后于显微镜（40倍目镜）下观察到的菌体很密集。视野中的细菌数量众多，且大部分连片，较难观察到具体形态；经染色后的细菌一律呈紫色，说明分离的菌种是革兰氏阳性菌。2.培养基浓度为10-4的菌种染色观察记录2.1选取菌落特征菌斑直径大约为1cm，菌种颜色呈米白色，边缘光滑，质

49、地较软，透明度较低。2.2染色显微镜观察结果图2 培养基浓度为10-4的菌种染色结果（拍摄自目镜）从显微镜观察结果来看，细菌仍然较多且较密，但没有连成一片的现象，细菌形态较清晰，各个细菌形态大多呈椭圆状或杆状，也有部分成不规则状，极少数成圆球状。颜色成紫色，说明观察的菌种为革兰氏阳性菌。3结果分析絮凝菌经革兰氏染色后呈现紫色，从两次观察拍摄的图片上菌体均是紫色，因此絮凝菌应该是革兰氏阳性细菌，与事实相符，说明染色成功。进行革兰氏染色时还需留意一些注意事项：固定时烘烤要适度，太轻会在冲洗时冲走细菌，过度会破坏细菌形态；脱色的时间要严格控制，脱色不够造成假阳性，脱色过度会出现假阴性；要选用新培养的

50、菌种，涂片时不能太厚（如果培养时间过长，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性，老龄的G+细菌细胞壁老化，不能在乙醇处理的时候使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，从而在复染时被染红）革兰氏染色可以迅速将细菌分为阴性和阳性，是很重要的染色方法，也是相当复杂的染色方法。通过练习革兰氏染色，既掌握了一般的染色方法，又为以后技术要求更高的染色，观察，鉴别奠定了基础。二、 饮用水卫生检验（一）细菌总数的检验1.材料与方法1.1材料：实验器材：灭菌后的1mL移液管、灭菌后的培养皿、酒精灯、隔水式恒温培养箱；实验试剂：营养琼脂培养基、95%乙醇棉球；1.2方法水龙头消毒：用95%乙醇浸泡

51、过的棉球擦拭水龙头，然后打开水龙头开关，让其放自来水5分钟；取样：用灭菌后的1mL移液管准确吸取1mL自来水至经灭菌后的培养皿中；制平板：将营养琼脂培养基融化，然后冷却至45C左右，以无菌操作，倾注于无菌培养皿内，其厚度约为0.3。培养：倒完平板后轻轻摇晃平板，使样品与培养基混合均匀。待培养基冷却后倒置平板并放置在隔水式恒温培养箱中培养2448h后移入冰箱。观察：观察细菌形态分布和数量并记录。2.结果与分析图3 自来水细菌总数培养2.1现象记录总计细菌数为：1个，面积很小，目测直径为0.3mm，形态上呈白色小点，由此推算自来水中的细菌总数约为 1000个/L。2.2结果分析查阅生活饮用水卫生标

52、准（GB5749-2006）中的表1：水质常规指标及限值，可知饮用水中的菌落总数限值为100CFU/mL。本次实验检验出自来水样中的细菌菌群为1CFU/mL，面积极小，几乎难以被察觉，说明测定的自来水水质极好。同期的其他组实验结果与本组实验结果近似，培养检验出自来水中的菌落数大多不超过3个；但也有极个别小组的自来水培养皿中长出了大面积的绒毛状霉菌斑，推测原因有三：一为自来水取样前的水龙头消毒工作没有做好；二是取样时没有注意保持无菌环境下操作，可能是火焰离平盘太远，导致空气中的霉菌落入平板；三是无菌滴定管从报纸中取出得太早，导致取样用的滴定管受污染。（二）大肠菌群的检验根据GB4789.3-20

53、10 中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定（National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms），分为三个步骤：初发酵试验、复发酵试验、大肠菌群最可能数（MPN）的报告。具体操作步骤如下：1.材料与方法1.1材料实验设备：隔水式恒温培养箱（361）、冰箱（25），高压灭菌锅实验仪器：1 mL无菌吸管（具0.01 mL 刻度）、15支试管带小倒管，试管架、酒精灯实验试剂：乳糖蛋白胨培养液（广东环凯微生物科技有限公司）单料（双料）液体培养基的配制：取2

54、3g（46g）乳糖蛋白胨培养液，加入蒸馏水过去离子水1L，加热煮沸至完全溶解，分装带有小倒管的试管，115高压灭菌20min。1.2方法a.初发酵试验培养基灭菌：取5支试管（每个试管底部各有1个小倒管倒置），分别加入10mL单料液体培养基；再取10支试管（底部倒置小倒管），分别加入5mL双料液体培养基；给5支单料培养基和10支双料培养基分别贴上标签后，包扎好后在115高压灭菌锅中高压灭菌20min。水龙头消毒：用95%乙醇浸泡过的棉球擦拭水龙头，然后打开水龙头开关，让其放自来水5分钟；取样和接种：用灭菌后的1mL移液管分别准确吸取1mL自来水至经灭菌后的5支单料液体培养基和10支双料液体培养基

55、；培养：将接种后的液体培养基做好标记后移入隔水式恒温培养箱（361）培养48 h2 h，然后再移入冰箱（25）以待观察。如果观察到倒管内有气泡产生，需进行复发酵试验。而未产气者为大肠菌群阴性。由于实验时间有限，所以本次实验只进行了初发酵试验及其结果观察，以下复发酵试验和大肠杆菌最可能数（MPN）的报告摘自GB4789.3-2010 中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定，作为参考。b.复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，361培养48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。c.大肠菌群最可能数（MPN）

56、的报告按上述确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。2.结果与分析2.1实验现象原理分析大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，由于分解乳糖产酸能使培养液中的紫色指示剂变成黄色，且产生的气体能使液体中的小试管浮起。阳性结果（有大肠菌群存在）：培养液颜色由紫色变为黄色（产酸）并且小倒管内有气泡产生（产气）；或者培养液颜色仍为紫色，但小试管中有气泡产生。假阳性结果（可能有大肠菌群存在）：培养液颜色由紫色变为黄色（产酸），但小倒管内没有气泡产生。（存在产酸菌，但不一定是大肠杆菌群，要进一步使用伊红美蓝培养基对菌种进行检测。） 阴性结果（无大肠菌群存在）：培养液不变色，小倒管内没有气泡产生。2.2实验现象记录初步发酵试验结果显示，5支单料液体培养基均没有出现变黄和产气的现象，结果如下图4所示：图4 单料液体培养基培养结果从图4中的培养结果可以看到，单料培养基中的小倒管没有出现气泡，且培养基的紫色指示剂没有变黄，说明单料培养基的培养结果为大肠杆菌阴性。而10支双料液体培养基也没有出现变黄和产气的现象，结果如下图5所示：图5 双料液体培养基培养结果从图5中的培养结果可以看到，双料培养基中的小倒管没有出现气泡，且培养