2019年各生理指标的测定方法.doc

1、各生理指标的测定方法一、脯氨酸含量的测定1. 茚三酮法1.1 原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等） 及植物衰老时， 植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100 倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在 520nm波长下比色， 从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。1.2 步骤试剂：（ 1）25%茚三酮：茚三酮-0.625g冰乙酸-15ml6mol/

2、L磷酸 -10ml70C水浴助溶；（ 2）6mol/L 磷酸： 85%磷酸稀释至原体积的2.3 倍；（ 3）3%磺基水杨酸：磺基水杨酸 -3g加蒸馏水至 -100ml实验步骤：（ 1）称取 0.1g 样品放入研钵， 加 5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆， 100 C沸水浴 15min ；（ 2）冰上冷却， 4000rpm 离心 10min；（ 3）提取液 2ml+冰醋酸 2ml+25%茚三酮 2ml 混合均匀， 100 C 沸水浴 30min，冰上冷却；（ 4）加 4ml 甲苯混合均匀，震荡30s，静置 30min；1.3（ 5）以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。计算方法脯氨酸含量（

3、 g/gFW） X *样品鲜重（提取液总量（ml） /g） * 测定时提取液用量（ml） *106公式中：X-从标准曲线中查得的脯氨酸含量（ g）提取液总量 -5ml测定时提取液用量-2ml问题及质疑：1.酸性体系下，脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色，再实验过程中，仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。2.经查看文献资料，反应步骤已经是优化的，没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物，消除了多余未反应的茚三酮，磺基水杨酸，提取液中其他杂质（如色素）以及PH 变化的干扰。3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析：（1）反应体系的PH控制很重要， 保持酸性环境， 否则，反应产物的最大吸光

4、值并不在520nm。（ 2）极限干旱材料或者重脱水材料的脯氨酸含量大，材料干重比新鲜材料多数倍，加相同量的茚三酮，反应程度应该有所不同。而脯氨酸含量少的样本，容易受到各种因素的干扰。二、丙二醛含量的测定1. 原理植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、是膜脂过氧化最重要的产物之一，脂类过氧化物、 丙二醛、 乙烷等。其中丙二醛 （ MDA ）因此可通过测定 MDA 了解膜脂过氧化的程度， 以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。丙二醛在高温及酸性环境下可与 2-硫代巴比妥酸（TBA ）反应产生红棕色的产物 3,5,5-三甲基恶唑2,

5、4-二酮（三甲川） ，该物质在532 nm 处有一吸收高峰，并且在660nm 处有较小光吸收。 由于醛、可溶性糖对此反应有干扰，在 450 nm 处有一吸收峰，用双组分分光光度法加以排除。2. 步骤试剂：（ 1） 10%三氯乙酸（ TCA ）： TCA -25g加 ddH2O至 -250ml（ 2） 0.6% 硫代巴比妥（ TBA ）： TBA -0.6g 加 5%TCA至 -100ml实验步骤：（ 1）称取材料0.1g ，加 10% TCA 2ml 研磨至匀浆，再加8ml 进一步研磨；（ 2） 4000rpm 离心 10min ，取上清至新管；（ 3） 2ml 提取液 +2ml 0.6% T

6、BA ，混合均匀， 2ml ddH2 O+2ml 0.6% TBA 为空白对照；（ 4）混合沸水浴 15min，冰上冷却；（ 5） 4000rpm 离心 10min ；（ 6）取上清再 532nm， 600nm， 450nm波长下的光密度值。3. 计算方法式中， Vt ：提取液总体积（mL） -10mlVs：测定用提取液体积（ml） -2mlFW：样品鲜重（ g） -0.1g；。注意事项：1可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm 也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于极度干旱时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。2低浓度的铁离子能增强 MDA与 TBA的显色反应，当植

7、物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为 0.5 nmol L-1 ）3如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。三、过氧化氢酶的活性测定 高锰酸钾滴定法【原理】过氧化氢酶（CAT ）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。2eR(Fe+2)+H 2O2=R(Fe +3+OH)2eR(Fe+3+2OH)2+H 2O2=R(Fe)2+2H 2O+O 2据此，可根据 H2O2 的消耗量或 O2 的生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）的H 2O2 溶液，经酶促反应后，

8、用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的 H2O25H2O2+2KMnO 4+4H 2SO45O2+2KHSO 4+8H 2O+2MnSO 4即可求出消耗的H 2O2 的量。【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml 4；酸式滴定管（ 10ml ）；恒温水浴；容量瓶 25ml 1。【试剂】10% H 2SO4； 0.2mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8；0.1mol/L 高锰酸钾标准液：称取KMnO4（ AR ）3.1605g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，用 0.1mol/L 草酸溶液标定；0.1mol/L H 2O2：市售 30% H 2 O2 大约等于17.6mol/L ，取 3

9、0% H 2O2 溶液 5.68ml ，稀释至1000ml ，用标准 0.1mol/ KMnO4 溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4 2H 2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L 。【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g 加入 pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心 15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。2.取 50ml 三角瓶 4 个（两个测定两个对照） ，测定瓶中加入酶液 2.5ml ，对照瓶中加入煮死酶液 2.5ml ，

10、再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2 ，同时计时，于 30恒温水浴中保温10min ，立即加入 10% H 2SO4 2.5ml 。3.用 0.1mol/L KMn 4 标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色 （在 30min 内不消失） 为终点。4.结果计算：酶活性用每克鲜重样品1min 内分解 H 2O2 的毫克数表示：( AB)V17.T酶活 (mgH 2O2 /gFW min)=FWV 1t式中 A 对照 KMnO 4 滴定毫升数；B 酶反应后KMnO 4 滴定毫升数；V T酶液总量（ml）；V 1反应所用酶液量（ml） ;W 样品鲜重（g）；1.7 1ml 0.1mol/L 的

11、 KMnO 4 相当于 1.7mg H 2O2。【注意 】所用 KMnO 4 溶液及 H 2O2 溶液临用前要经过重新标定。四、植物叶绿素含量的测定（分光光度法）一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收， 利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度， 即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度 A 与其中溶质浓度 C和液层厚度 L 成正比，即 A CL式中： 比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时， 为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此

12、混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素 a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素 a 和 b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素 a 和叶绿素 b 的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，比值小则反之。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。（二）仪器

13、设备： 1）分光光度计； 2）电子顶载天平（感量0.01g ）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5 ）小漏斗； 6）定量滤纸； 7）吸水纸； 8 ）擦境纸； 9）滴管。（三）试剂： 1）95%乙醇（或 80%丙酮）；2）石英砂； 3）碳酸钙粉。三、实验步骤（ 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织），擦净组织表面污物， 剪碎（去掉中脉），混匀。（ 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及 23ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇 10ml，继续研磨至组织变白。静置 35min。（ 3）取滤纸 1 张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到 25ml

14、棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。（ 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 25ml，摇匀。（ 5）把叶绿体色素提取液倒入光径 1cm 的比色杯内， 以 95%乙醇为空白 ，在波长 663nm和 645nm下测定吸光度。四、（ 4） 95%乙醇为空白对照，在645nm、 663nm、 652nm波长下测定光密度值。1.3D计算方法663=82.04Ca +9.27CbD645=16.75Ca +45.6Cb(浓度单位：g/mL ）CA= 12.72D663 2.59D 645CB= 2

15、2.88D645 4.68 D 663CT = 20.29D645 +8.02D 663(浓度单位： mg/L）Chl(mg/g叶 )= C(mg/L)*提取液总量（ L） * 稀释倍数 /FW（ g）注意事项：（ 1）避光。（ 2）时间控制，研磨以及放置时间不宜过长。（ 3）叶绿素一定要提干净，以免造成误差。叶绿素 a、 b 的总含量 = 8.02 OD663 + 20.20 OD645 注意： 1. 叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差2. 叶绿素初提液体积不要太多， 以免浪费试剂， 如果浓度太高可进行适当稀释六、种子淀粉酶活性的测定一【原理】几乎所有植物中都存在淀粉酶， 尤其是萌发的禾谷

16、类种子， 淀粉酶活性最强。主要是 -淀粉酶和 -淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类， 供幼苗生长。-淀粉酶随机水解淀粉的 -1,4- 糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用； 其水解产物为麦芽糖、 麦芽三糖、 糊精等还原糖； -淀粉酶水解非还原端的第二个 -1,4- 糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。两种淀粉酶具有不同理化特性， -淀粉酶不耐酸，在 pH3.6 以下迅速钝化；-淀粉酶不耐热，在 70 下 15min 则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化 -淀粉酶测出 -淀粉酶活力，再与非钝化条

17、件下测得的总淀粉酶活力比较，求出 -淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与 3,5- 二硝基水杨酸试剂反应， 使其还原生成红色 3-氨基 -5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。二【仪器与用具】分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；具塞刻度试管（ 25ml13）；吸管（ 1ml ， 2ml ，5ml 各 1 支）；容量瓶（ 50ml2）。三【试剂】1)麦芽糖标准液（ 1mg/ml ）：称取 100mg 麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100

18、ml ；2) 3,5- 二硝基水杨酸试剂（ DNS 试剂）：精确称取 3,5- 二硝基水杨酸 1g，溶于 20ml 2mol/L NaOH 溶液中，加入 50ml 蒸馏水，再加入 30g 酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至 100ml 。盖紧瓶塞，勿使 CO2 进入。若溶液混浊可过滤后使用；3)0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：配制方法如下:A 液（ 0.1mol/L 柠檬酸） 称取分析纯柠檬酸 21.01g ，用蒸馏水溶解并定容至 1L；B 液(0.1mol/L 柠檬酸钠 )称取柠檬酸钠 29.41g 用蒸馏水溶解并定容至1L ；取 A 液 55ml 与 B 液 145ml 混匀，

19、即为 0.1mol/L pH5.6 的柠檬酸缓冲液；4) 1% 淀粉溶液：称取 1g 淀粉溶于 100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。以下按论文顺序 :1 材料1.1 材料取自大润发超市1.2 方法材料处理发芽处理时，称取干种子40 克，放在烧杯里用水浸润2 小时以上，浸好后放在垫有纱布的培养皿上，种子上面再放浸湿的一层纱布，盖好，放在 30 度的培养箱里培养。每培养一天，要对种子及纱布进行水投处理。标准曲线测定取试管 7 个编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml ）0.0 ，0.2 ， 0.6， 1.0 ，1.4 ，1.8 ，2.0ml ，然后加蒸馏水使各管都达到 2.

20、0ml 。再各加入 3，5-二硝基水杨酸 2.0ml ，置沸水浴中 5min ，冷却后再用蒸馏水稀释至 25ml ，即再加蒸馏水 21 ml 。在 520nm 处测其吸光值（ A）。以麦芽糖浓度为横坐标， 以吸光度为纵坐标作曲线， 即为麦芽糖的标准曲线。样品的测定酶液的提取 称取 1g 样品研磨成匀浆，取 10ml 蒸馏水用以研磨和洗涮研钵，移入离心管后在室温下放置 15 20min ，每隔数分钟搅动 1 次，使其充分提取。在 3000rpm 转速下离心 5min ，取上清液倒入 50ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液 5ml ，放入 50ml 容量瓶

21、中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。淀粉酶活性的测定 取 4 支试管编号，先取 2 支，测定 -淀粉酶活性 ,于每管中各加入酶提取液 1.0ml 。各管在 70 度恒温水浴中预热 15min 。取出迅速冷却。再取另 2 支，测定总淀粉酶活性 ,于每管中各加入酶稀释液 1.0ml 。在四个试管中均加入的柠檬酸缓冲液。并均置 40 度恒温水浴 15min ，再分别在各管中加入 40 度预热的淀粉溶液 2.0ml ，混匀，立即放入 40 度水浴中保温 15min ，以促进酶促反应，再向各管中迅速加入，以终止酶的活性，然后准备测定。(为便于操作可参考下列表1)再取各管的处理溶液 2.0ml

22、，放入 25ml 试管中，再加入 2.0ml 3 ， 5-二硝基水杨酸试剂，混匀。置沸水浴中 5min ，冷却后再用蒸馏水稀释至 25ml 。在 520nm 处测其吸光值（ A）。并将 1 和 2 管， 3 和 4 管计算平均值。然后由此平均数值从标准曲线中查出相应的麦芽糖含量（mg ）。计算1）-淀粉酶活性（麦芽糖 mg/g 鲜重 5min ）=-淀粉酶麦芽糖含量 样品稀释体积 /样品重（ g） 显色时所用酶液体积2）总淀粉酶活性（麦芽糖 mg/g 鲜重 5min ） =总淀粉酶麦芽糖含量样液稀释体积 /样品重（ g） 显色时所用酶液体积附：样液稀液体积 （-淀粉酶为 50ml, 总淀粉酶为

23、 500ml ）；样品重为 1 克。显色时所用酶液体积 25 ml附表 1：淀粉酶测定操作步骤表表 1 淀粉酶测定操作步骤表-淀粉酶活性总淀粉酶活性试管编号1234酶提取液 ml110 0淀粉酶稀释液 ml-101070 度恒温水浴中-预热 15min ，取出迅速冷却。pH5.6 的柠檬酸缓1101010冲液 ml 0置 40 度恒温水浴 15min40 度预热的淀粉溶2202020液 ml 0再置 40 度恒温水浴 15min ，0.4mol/LNaOH 溶4404040液 ml 0附表 2：标准曲线测定数据记录表表 2.1标准曲线测定数据记录表浓度0.00.20.61.01.41.82.0

24、吸光度附表 3、4、5：三次样品测定数据记录及计算用表表 2.2 第一次样品测定数据记录表-淀粉酶总淀粉酶试管编号1234吸光值平均值查标准曲线得麦芽糖浓度，或用方程计算据公式算-淀粉酶酶活 =总淀粉酶酶活 =出酶活性（麦芽糖 mg/g 鲜重5min ）表 2.3 第二次样品测定数据记录表-淀粉酶总淀粉酶试管编号1234吸光值平均值查标准曲线得麦芽糖浓度据公式算-淀粉酶酶活 =总淀粉酶酶活 =出酶活（麦芽糖mg/g 鲜重5min ）表 2.4 第三次样品测定数据记录表-淀粉酶总淀粉酶试管编号1234吸光值平均值查标准曲线得麦芽糖浓度据公式算-淀粉酶酶活 =总淀粉酶酶活 =出酶活（麦芽糖mg/g

25、 鲜重5min ）七、可溶性糖含量的测定1. 蒽酮法1.1 原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的 糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮 反应生成 蓝绿色糠醛衍生物，在可见光吸收峰位620nm。测定对象： 几乎可以测定所有的碳水化合物，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、 纤维素等 （反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量）。1.2步骤试剂： (1) 浓硫酸；(2) 蒽酮乙酸乙酯试剂：蒽酮 -1g加乙酸乙酯至 -50ml实验步骤：（ 1） 称取样品 0.1g ，置于研钵中， 加 4ml ddH

26、2O研磨成匀浆， 8ml ddH2 O洗涤研钵。（ 2） 100 C沸水浴 10min，冰上冷却。（ 3） 4000rpm 离心 10min。（ 4） 取上清 5ml 转移至 100ml 容量瓶定容。（ 5） 1ml 提取液 + 1ml ddH 2 O+0.5ml 蒽酮 +5ml 浓硫酸，轻轻混合均匀，100 C 沸水浴 10min，冰上冷却。（ 6）620nm处测吸光值。1.3计算方法可溶性糖含量% =C*V/(W*106)*100%V 为植物样品稀释后的体积（ml） -100mlC为提取液的含糖量（g/ml ） -根据标准曲线计算W为植物组织鲜重量（g）-0.1g问题及质疑：1. 目标糖含

27、量：标准曲线是用葡萄糖位标准制作的，而蒽酮法是测总糖的量，包括己糖、戊糖，浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖，将总糖得出的 OD值代入由单一糖做出的标准曲线，有一定误差存在。注：查看所有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。2. 误差分析：（1）不同糖类与蒽酮试剂反应的显色程度不同。果糖最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖最浅造成误差。（ 2）蒽酮试剂溶解度较低，非常容易析出，在反应时加入糖的水溶液中，出现浑浊现象，影响反应进行。 （ 3）介于以上原因，将上清 5ml 转移至 100ml 容量瓶定容，稀释程度过大，当糖含量少的时候，大的误差可能会掩盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。方案修

28、改意见：1. 首先，做五到六组空白，测试分光光度计误差程度。2. 增加平行组数，由三组增加至五组，减少每个样品测试次数。改变测试样品定容量，由 100ml 变为 50ml 。八、植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位mg 蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry 法和考马斯亮蓝G-250 染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。一、考马斯亮蓝法【原理】考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量属于染料

29、结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（ 0 100 g/ml ），蛋白质色素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。【仪器与用具】分光光度计， 10ml刻度试管14 支。量筒1 支；研体；10ml容量瓶1 支； 1ml刻度吸管3 支； 10ml具

30、塞【试剂】（ 1）牛血清白蛋白配成 1000 g/ml 和 100 g/ml ；（ 2）考马斯亮蓝 G-250：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50ml 90% 乙醇中，加入 85%（W/V ）磷酸 100ml ，最后用蒸馏水定容至1000ml 。此溶液在常温下可放置一个月；（ 3） 90%乙醇；（ 4）磷酸（ 85%， W/V ）。【方法】1.标准曲线的绘制（ 1） 0 100 g/ml 标准曲线的制作取 6 支试管，按表28-1 数据配制 0 100 g/ml血清白蛋白液各 1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml ，分别放入 10ml 具塞试管中，加入 5ml考马斯亮蓝 G

31、-250 试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min 后，在 595nm 下比色，绘制标准曲线。表 28-1 配制 0 100g/ml 血清白蛋白液管 号123456100g/ml 牛血清蛋白量 (ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量 (ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量 (mg)00.020.040.060.080.10g/ml（ 2） 0 1000 g/ml 牛血清白蛋白溶液各标准曲线的制作 1ml 。与步骤（另取 6 支试管，按表 28-2 数据配制 01000 1）操作相同，绘出 0 1000 g/ml 的标准曲线。表 28-2 配制 01000 g/ml 血清蛋白

32、血液管号7891011121000 g/ml 牛血清白蛋白（ ml ）00.20.40.60.81.0蒸馏水量 (ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量 (mg)00.20.40.60.81.02.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml （样品提取见各酶活测定） ，放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入 5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，充分混合，放置2min 后在 595nm 下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。3.结果计算CVa样品蛋白质含量（ mg/g 鲜重） = W式中 C查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V 提取液总体积（ ml）；a测

33、定所取提取液体积（ml）；W 取样量（ g）。九、植物细胞质膜透性的测定一、目的植物细胞质膜是细胞与外界环境的一道分界面，对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。 但植物常受到外界不良因子的影响，而不同植物种类其抗逆性则不同。用电导仪率法测定植物质膜透性的变化，可作为植物抗逆性的生理指标之一。本实验主要测定低温对细胞质膜透性的影响，并掌握用电导仪法测定植物细胞质膜透性的原理及方法。二、原理植物细胞的细胞质由一层质膜包围着，这种质膜具有选择透性的独特功能。植物细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。 各种不良环境因素对细胞的影响往往首先作用于这层由类脂和蛋白质所构成的生物膜。

34、如极端的温度、干旱、盐渍，重金属离子（如 Cd2 等）和大气污染物（如 SO2、 HF、 O3）等都会使质膜受到不同程度的损伤，其表现往往为细胞膜透性增大， 细胞内部分电解质外渗， 外液电导率增大。 该变化可用电导仪测定出来。细胞膜透性变得愈大，表示受害愈重，抗性愈弱，反之则抗性愈强。三、材料、仪器设备1. 材料：植物叶片。2. 仪器设备： 电导仪； 电子天平； 冰箱；真空泵； 真空干燥器； 恒温培养箱； 电炉； 50ml烧杯； 50ml 量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。四、实验步骤1. 清洗用具所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗，然后用自来水、蒸馏水洗3次，

35、干燥后备用。2. 实验材料的准备及处理选取叶龄相似的植物叶片，剪下后用湿布包住。 实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗1 2次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后剪成约21cm的小叶片（或用直径为 1的打孔器钻取小园片） ，注意除掉大叶脉。 将剪下的小叶片混合均匀，快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、 B、 C 的三个烧杯中。作如下处理：A 杯放入冰箱 0以下作低温处理，处理 15 30min 后取出（供试叶片也可以在实验前低温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定），加入蒸馏水50ml。B 杯常温处理，加入蒸馏水50ml。将 A、 B 二杯放入

36、真空干燥器，用真空泵抽气20 30min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B 杯。C 杯加入蒸馏水 50ml，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸1015min （煮沸时间依不同植物叶片而定） ，冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续浸泡叶片。将 A、 B、 C 三杯放置室温下浸提1 h 左右（经常摇动，以有利电解质外渗）。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。3. 电导率测定用电导仪分别测定 A、 B、C 三杯的电导率，同时测定蒸馏水（空白）的电导率（注意：每测定完一个样液后， 用蒸馏水漂洗电极， 再用滤纸将电极擦干， 然后进行下一个样液的测定），所测得的结果记入下表

37、：电导率测定记录表处理电导率 ( S cm 1)电解质的相对外渗率（）蒸馏水（空白）A（低温）B（常温）C（煮沸）五、结果计算按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率：处理电导率空白电导率电解质的相对外渗率（） 100 煮沸电导率 空白电导率十、过氧化物酶活性的测定（比色法）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm处有最大吸收，可用分光光度计测量

38、470 nm处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。一、仪器、药品与材料（一）实验材料新鲜植物组织。（二）仪器与用品分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。（三）试剂愈创木酚。 30过氧化氢。 100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0（见附录 7）。反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（ pH 6.0 ） 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 L，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 % 过氧化氢 19 L，混合均匀，保存于冰箱中备用。二、实验步骤1称取植物材料 0.1 g，剪碎，放入研钵中，加入

39、适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以4000 rpm 低温离心15 min，上清液即为粗酶液，定容至10 mL 刻度，贮于低温下备用。2取 2 支试管，于1 只中加入反应混合液3 mL和磷酸缓冲液 1mL，作为对照，另 1 支中加入反应混合液3 mL 和上述酶液 1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度（ OD）值，每隔 10S 读数一次。3结果计算：以每分钟OD变化值（A470 / gFW min）表示酶活性大小，。也可以用每min OD 值变化0.01

40、作为 1 个过氧化物酶活性单位（U）表示。过氧化物酶活性（U/gFWmin） =A470VT/W VS 0.01 t式中：A470反应时间内OD变化值。VT提取酶液总体积（mL）。W 植物鲜重（ g）。Vs测定时取用酶液体积（mL）。t 反应时间（ min ）。十一、呼吸速率的测定一、实验目的：掌握小篮子法测定植物呼吸速率二、实验原理：植物进行呼吸作用放出CO2，计算一定植物样品在单位时间内放出CO2 数量，即为该样品的呼吸强度。 呼吸作用的强弱即呼吸速率的大小是植物生命活动最重要的指标之一。一般地说，呼吸速率大表示新陈代谢旺盛，呼吸速率小则说明代谢活动弱，植物呼吸速率的大小因植物类型、 组织

41、种类、生育期的差异而不同，也受着外界环境的影响。 测定呼吸速率的方法很多，如红外线 CO2 分析法，氧电极法，瓦氏呼吸仪法，呼吸瓶法等。本实验采用广口瓶与小篮子测定呼吸速率的方法。植物进行呼吸时吸收O ，放出 CO ，计算一定的植物样品22在单位时间内放出CO2的数量，即为该样品的呼吸速率。植物材料呼吸过程中释放的CO2可用氢氧化钡溶液吸收。实验结束后， 用草酸溶液滴定剩余碱量，由空白和样品二者消耗草酸溶液的之差即可计算出呼吸过程中释放的CO2量。三、仪器、药品与材料（一）实验材料橘子 生毛豆熟毛豆（二）仪器与用品500ml 广口瓶，天平，酸碱滴定台与酸式滴定管，量筒，天平，钟表，温度计，干燥

42、管，尼龙网制小篮。（三）试剂1 0.05 mol/L 左右的 Ba(OH) 2：称取 8.6 g Ba(OH)2溶于 1000 mL 蒸馏水中，密封保存。21/44 mol/L 草酸溶液： 准确称取2.8651 g 重结晶的 H C O ?2H O 溶于蒸馏水中并定容至22221000 mL 。3酚酞指示剂：称取1 g 酚酞溶于100 mL 95 乙醇中，并贮于滴瓶中。二、实验步骤1取 500 mL 广口瓶一个，瓶口用打有二孔的橡皮塞塞紧，一孔插一盛碱石灰的干燥管，使呼吸过程中能进入无CO2 的空气，另一孔直径约1 cm，供滴定用，平时用一小橡皮塞塞紧。瓶塞下方挂一小篮，以便装植物样品（也可用

43、单层纱布包裹种子代替）。2向瓶中准确加入约0.05 mol/L 的 Ba(OH) 2 溶液 20 mL ，立即塞紧橡皮塞（不加样品），充分摇动广口瓶 2 min，待瓶内 CO2全部被吸收后， 拔出小橡皮管塞， 加入酚酞指示剂 2 滴，把滴定管插入孔中， 用标准草酸溶液进行空白滴定，直到红色刚刚消失为止。记录所用草酸溶液体积 V 0 mL 。3倒出废液，用无 CO2 的蒸馏水（煮沸过的）洗净后，重加上述Ba(OH) 2 溶液 20 mL ，同时称取植物样品2030 g，装入小篮子中，挂于橡皮塞下，塞紧瓶塞，并用熔化的石蜡密封瓶口，防止漏气。开始记录时间，每过 10min 左右，轻轻地摇动广口瓶数次，使溶液表面的 BaCO 3 薄膜被破坏，以利于充分吸收 CO2。1 小时后，小心打开瓶塞，迅速取出小篮，加12 滴指示剂，立即重新盖紧瓶塞混匀，然后拔出小橡皮塞，把滴定管插入小孔中，用草酸滴定，直到红色刚刚消失为止。记录所用草酸溶液体积V 1mL 。4结果计算（1）计算公式：植物呼吸速率Rn=(Ci-C 0) h?m?V 0h 为时间（ 10min ）， m 为质量， V 0 规定为 =4.5 升 ， C0 为初值 CO2 浓度（）， Ci 为终值CO2 浓度（）（2）数据记录及处理：样品重量C0CiRn橘子283.70.0450.0490.0003生毛豆248.30.