超高效液相色谱的应用现状和发展前景

1、超高效液相色谱的应用现状和发展前景 生物分离工程课堂报告之 Speaker:黄妙珍 09生物技术三班 2011.11.3 色谱分离精度高，设备简 单，操作方便，根据各种 原理进行分离的色谱法不 仅普遍应用于物质成分的 定量分析和检测，而且广 泛应用于生物物质的制备 分离和纯化。是目前最好 的生物纯化技术。 常见的分离方式 蒸馏蒸馏 离心 电泳电泳 过滤过滤 超滤超滤 色谱色谱 色谱分类 4 2 3 1 色谱色谱 柱状色谱柱状色谱 薄层色谱薄层色谱 纸色谱纸色谱 色相色谱色相色谱 高效液相色谱高效液相色谱 超高效液相色谱超高效液相色谱 色谱典型的仪器配置 色谱泵及控制器色谱泵及控制器 数据处理及

2、控制数据处理及控制 进样器进样器 色谱柱色谱柱 检测器检测器 W ate rs 486 分离度 色谱条件的优化 速度容量 开发液相色谱方法 分辨率是色谱分离中主要考虑的因素 在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下几个因素 都要考虑。 灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗 Click to add title in here 自自20世纪世纪70年代以来，随着高效液相色谱年代以来，随着高效液相色谱 (High Performance Liquid Chromatography， HPLC)技术的不断发展，美国技术的不断发展，美国Waters公司于公司于2004 年的匹兹堡会议上

3、推出了最新研制的年的匹兹堡会议上推出了最新研制的ACQUITY超超 高效液相色谱高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)，其采用，其采用17 Ixm细细 粒径的新型固定相，可获得高达粒径的新型固定相，可获得高达2万块万块m理论塔理论塔 板数的超高柱效，并以系统整体设计的创新技术，板数的超高柱效，并以系统整体设计的创新技术， 全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度， 造就了液相色谱性能上的飞跃和进步并形成分离造就了液相色谱性能上的飞跃和进步并形成分离 科学的一个新兴领域。科学的一个新兴领域

4、。 超高效液相色谱 Click to add title in here 超高效液相色谱 （UPLC）的原理 UPLC的理论基础为： 范德米特范德米特(Van Deemeter)方程方程 HETP=AdP+Bv+CdP2 HETP：理论塔板高度：理论塔板高度 A：涡流扩散系数：涡流扩散系数 由该方程可得出结论： 颗粒度越小柱效越高；每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱 效的流速；更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方 向移动，而且有更宽的线速度范围所以降低颗粒度不但提高柱 效，同时也提高速度。 dlP：填料粒径：填料粒径 B：分子径向扩散系数：分子径向扩散系数 C：传质因子为流动相线速度：传质

5、因子为流动相线速度 van Deemter曲线的提示 Click to add title in here Click to add title in here 如果填料的颗粒继续演变如果填料的颗粒继续演变 未来的色谱:更小的颗粒度 液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的改变直 接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。由上图可知：随 着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。 小颗粒分离的理论与科学基础小颗粒分离的理论与科学基础 更小颗粒度所面临的挑战 Click to add title in here 小颗粒带来生产力 基于17 m小颗粒技术的UPLC与人们熟知的高效液相色谱(

6、HPLC)技术，具有相 同的分离原理。不同的是，UPLC不仅比HPLC具有更高的分离能力，而且结束了 人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。使用UPLC可以在很宽的线速 度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果 -UPLC的优点 超高分离度 图3: UPLCTM与HPLC：分离度比较 由右图可见：由右图可见：UPLCTMUPLCTM 可以大大提高分离度，可以大大提高分离度， 同时色谱峰强度也得到同时色谱峰强度也得到 了提高。了提高。 小颗粒带来生产力 -UPLC的优点 超高速度 图4: UPLC与HPLC：速度比较 图5：UPLC美国药典有关物质分析实例 原有原有HPLCHP

7、LC分析需要分析需要4 4个不同的方法、个不同的方法、 三根不同的色谱柱，至少需要三根不同的色谱柱，至少需要6565分分 钟才能完成；钟才能完成；UPLCUPLC使用了一根色谱使用了一根色谱 柱、一种简单方法，在柱、一种简单方法，在1 1分钟内即可分钟内即可 完成。完成。 小颗粒带来生产力 -UPLC的优点 超高灵敏度速度 图6: HPLC到UPLCTM：灵敏度的改善无需折衷 UPLCTM使用小颗 粒技术可以得到更 高的柱效（因而改 善了分离度）、更 窄的色谱峰宽，即 更高的灵敏度。 UPLC仪器构造 UPLC仪器构造 Click to add title in here UPLC仪器模式图

8、UPLC数据采集软件 Empower软件软件 MassLynx 为高性能质谱应用 程序，用于采集、分析、管理 和分布 UV 及质谱数据。它提 供 了智能仪器控制，可以采集额 定质谱、完全质谱、MS/MS 和完全质谱 MS/MS 数据。 MassLynx软件软件 Empower 具有基于图标和图形的用 户界面，可用于采集、处理、管理、 报告和存储色谱数 据。 UPLC的样品瓶和样品板 与UPLC匹配 的色谱柱比较少 峰面积的重复性欠佳 对高频检测仪器的需要 超高效液相色谱的局限性 尽管UPLC能显著减少复杂样品的分析分离时间，提高检测的灵敏度和分离度，但 目前UPLC的使用仍然存在局限性，其普及

9、应用可能仍然需要一些时间。 色谱柱要能够耐受由于粒径减小而带来的高 反压，而且粒径的减小也给色谱柱充填技术 带来了挑战。 UPLC分析样品时峰面积的重复性略逊 于HPLC，特别是低浓度样品时更加明 显，其峰面积重复性的RSD约为HPLC 的2倍。 UPLC分离样品色谱峰扩展很小，通常峰底宽 度只有几秒钟，低浓度的样品峰则更窄。 OConnor等 发现，使用UPLC测定低浓度 样品时，准确度、精密度都比较差。 Click to add title in here 超高效液相色谱的应用现状 1.食品安全领域 1.1农药残留物检测领域 1.2食品添加剂分析检测中的应用 农药残留分析属于微量至超微量分

10、析范畴，要求检测仪器有非常 高的灵敏度；同时，由于其具有种类繁多、结构复杂等特点，对 检测方法的通量和速度也提出了更高的要求。在农残分析检测中， UPLC与传统的HPLC 相比较，不仅在分离度、灵敏度和分析速 度上得到较大提高，而且很大程度上减少了样品和试剂的消耗量， 具有很好的应用前景。 随着食品品种和添加剂种类的增加、多种添加剂的复配使用，迫 切需要建立多种添加剂同时快速检测的方法。目前，HPLC 技术 是食品添加剂检测的最常用方法；而较这一传统方法而言，在技 术性能上拥有优势的UPLC 得到了更突出的应用。 超高效液相色谱的应用现状 2.药物开发领域 2.1化学药品分析 2.2中药药品分

11、析 在针对药物合成的分析方面，UPLC可实现随时快速准确检测合成过 程中的中间体、副产物或降解产物等。 Waters公司合成了17 pm颗粒度的Acquity UPLC填料，减少了固 定相表面残余硅羟基，因而在分析生物碱类样品时，流动相中只加入酸 抑制剂，不需添加有机胺即可使其获得良好的分离。由于在流动相中避 免了有机胺及盐的加入，可以在一定程度上降低质谱噪音、减少对质谱 的污染，且使用的流速适合与质谱直接联用，无需分流，可以进一步提 高检测灵敏度，为中药分析提供良好的平台。 超高效液相色谱的应用现状 3.其他领域 农药残留物检测 水质和环境监测 化妆品质量控制 . 超高效液相色谱与其他技术的

12、交叉应用 merit 超高效液相色谱和高效液相色谱联合 固相萃取一超高效液相色谱一串联质谱法 气相萃取一超高效液相色谱一串联质谱法 王文昭、李鹏等8基于超高效液相色谱和高效液相色谱的偏最小二乘 判别分析法建立了一种新型的区别诊断乳腺增生和乳腺癌患者的快速临 床方法。 超高效液相色谱一串联质谱法(UPLCMS-MS)9具有更加简便、快 速、灵敏的特点，特异性好、能够排除基质干扰，定量限更低、定性 更准确，是分析组织中氯羟吡啶残留的理想方法。 陈跃 应用超高效液相色谱串联质谱联用(UPLCMSMS)技 术，建立了高灵敏、快速的同时检测农产品中8种种衣剂农药 残留量的方法。 超高效液相色谱仪的制造

13、在世界领域的UPLC研发生产中，Waters作为专业液相色谱的厂商，是业界 唯一同时拥有液相色谱所有组件技术包括液相色谱仪器硬件、填料技术和软 件技术的供应商，拥有液相色谱技术最强大的科研和生产机构。 从六十年代首推世界上第一台液相色谱(LC)系统，到七十年代高效液相色 谱(HPLC)技术的商品化，直至2004年超高效液相色谱(UPLC)系统的推出， Waters是色谱技术公认的领导者11。 Waters世界世界专业液相色谱的厂商 超高效液相色谱的发展前景 UPLC是一种较为新颖的技术手段，与传统分析方法相比具有多 方面的优势。 UPLC可以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，沃 特世将致力于丰富已有的UPLC产品，现已推出了六种新的色 谱柱，包括:BEH C18、C8、苯基和ShieldRP18、 HILIC 及 HSS T3。同时还