土源性线虫和食源性寄生虫检测方法

1、土源性线虫和食源性寄生虫检土源性线虫和食源性寄生虫检测方法测方法20162016年年5 5月月2929日日一、改良加藤厚涂片法改良加藤厚涂片法二、透明胶纸肛拭法二、透明胶纸肛拭法三、三、试管滤纸培养法试管滤纸培养法四、土壤中钩蚴分离改良方法四、土壤中钩蚴分离改良方法五、土壤中人蛔虫卵检查及活力测定方法五、土壤中人蛔虫卵检查及活力测定方法六、猪体囊尾蚴检测方法六、猪体囊尾蚴检测方法七、肉类中旋毛虫检验方法七、肉类中旋毛虫检验方法八、囊尾蚴病和旋毛虫病血清学检测方法八、囊尾蚴病和旋毛虫病血清学检测方法一、改良加藤厚涂片法一、改良加藤厚涂片法加藤厚涂片法是50年代日本人Kato首先提出，是用在甘油透

2、明液中浸泡过的亲水玻璃纸替代盖玻片。七十年代Katz设计出圆孔卡片用于定量，此后称为改良加藤厚涂片法。八十年代起，中国疾控中心寄生虫病所对定量板进行了多次改进。检出率高，操作简便、适用于粪便中各种寄生虫卵检测。1988年至今我国实施的大规模寄生虫病调查，粪检用的都是该方法。背景一、改良加藤厚涂片法一、改良加藤厚涂片法透明液（蒸馏水透明液（蒸馏水100ml纯甘油纯甘油100ml3%孔雀绿孔雀绿1ml);亲水性透明玻璃纸亲水性透明玻璃纸( (2540mm) )需在透明液中浸泡需在透明液中浸泡2424小时小时 以上；以上；尼龙绢片（尼龙绢片（80目）裁剪大小目）裁剪大小55cm；圆台形孔塑料定量板；

3、圆台形孔塑料定量板；塑料刮片。塑料刮片。其他：原始登记表、镊子、剪刀、记号笔、标本盒、旧报其他：原始登记表、镊子、剪刀、记号笔、标本盒、旧报纸、吸水纸、光学显微镜和一次性手套等。纸、吸水纸、光学显微镜和一次性手套等。材料一、改良加藤厚涂片法一、改良加藤厚涂片法步骤刮刮填填盖盖压压透透一一、改良加藤厚涂片法改良加藤厚涂片法1 1）每份粪样取每份粪样取2张载玻片进行编号（与待检粪样的编号张载玻片进行编号（与待检粪样的编号相同）相同）2 2）将）将8080目的尼龙绢摊在粪样上，用刮棒压平后目的尼龙绢摊在粪样上，用刮棒压平后刮刮取粪便。取粪便。3 3）将定量板放置玻片中央，定量孔小孔朝上，将粪样）将定

4、量板放置玻片中央，定量孔小孔朝上，将粪样填填满、抹平。满、抹平。一一、改良加藤厚涂片法改良加藤厚涂片法4）垂直向上移去定量板，将亲水玻璃纸抖）垂直向上移去定量板，将亲水玻璃纸抖掉多余水分，掉多余水分，盖盖在粪样上；在粪样上；5）取另一张载玻片轻）取另一张载玻片轻压压粪样，均匀展开粪样，均匀展开至玻片边缘；至玻片边缘；6）待加藤片）待加藤片透透明后镜检明后镜检一一、改良加藤厚涂片法改良加藤厚涂片法记录下每张片子的各种虫卵数记录下每张片子的各种虫卵数;当每个视野中的蛔虫卵数当每个视野中的蛔虫卵数在在10个以上时个以上时,可固定抽查可固定抽查10个视野个视野,将将 10个视野的虫卵个视野的虫卵平均数

5、乘以全片的视野数，得到全片虫卵数近似值。平均数乘以全片的视野数，得到全片虫卵数近似值。例：例：抽查的抽查的10个视野蛔虫卵数相加为个视野蛔虫卵数相加为366，全片粪膜视野数为，全片粪膜视野数为78，则全片粪膜蛔虫卵总数（，则全片粪膜蛔虫卵总数（ 36610 ）782854.82855镜检（1）受检者需提供足量的粪样，约）受检者需提供足量的粪样，约50g（鸡蛋大小）。（鸡蛋大小）。（2）加藤片的粪样应厚薄均匀，不能逸出玻片边缘。）加藤片的粪样应厚薄均匀，不能逸出玻片边缘。（3）涂片放置时间长短是关键。一般室温）涂片放置时间长短是关键。一般室温25、75湿度湿度下，涂片放置下，涂片放置不宜超过不宜

6、超过2小时小时。只要透明了，就应及时镜。只要透明了，就应及时镜检，否则透明过度，薄壳虫卵易变形看不清楚。检，否则透明过度，薄壳虫卵易变形看不清楚。（4）登记粪检结果时，分别填写每张加藤片的各种虫卵数）登记粪检结果时，分别填写每张加藤片的各种虫卵数（不要乘不要乘24）。）。（5）调节显微镜左右目镜的距离和焦距。）调节显微镜左右目镜的距离和焦距。一、改良加藤厚涂片法一、改良加藤厚涂片法注意事项二、透明胶纸肛拭法二、透明胶纸肛拭法材料材料透明胶贴载玻片二、透明胶纸肛拭法二、透明胶纸肛拭法检测步骤检测步骤1）在胶贴纸上记录受检者编号等信息，将胶贴纸有粘性一面向外；二、透明胶纸肛拭法二、透明胶纸肛拭法2

7、） 用食指和拇指分开受检儿童的肛门，尽量分开肛周褶皱 ，将透明胶贴纸在肛门口反复粘压。二、透明胶纸肛拭法二、透明胶纸肛拭法3)将采样后的胶贴纸贴回载玻片，抹平，减少气泡产生。二、透明胶纸肛拭法二、透明胶纸肛拭法要求要求39岁儿童只检查岁儿童只检查1次。次。虫卵不计数，只虫卵不计数，只记录记录阴性、阳性阴性、阳性。蛲虫有夜间排卵的习性蛲虫有夜间排卵的习性,采样宜在清晨采样宜在清晨,采样采样前不要洗澡或清洗肛门前不要洗澡或清洗肛门,以免漏检。以免漏检。三、三、试管滤纸培养法试管滤纸培养法锥形离心管（长锥形离心管（长11.5cm、管口内径、管口内径1.5cm）。）。试管架、吸管、载玻片、盖玻片试管架

8、、吸管、载玻片、盖玻片(2020mm)、小镊子、小镊子、滤纸条（宽度略大于试管直径，长度略短于试管，约滤纸条（宽度略大于试管直径，长度略短于试管，约9.01.6cm，滤纸条要用剪刀剪，防止毛边）、，滤纸条要用剪刀剪，防止毛边）、显微镜、温箱、解剖镜或放大镜、竹签、旧报纸、橡皮筋。显微镜、温箱、解剖镜或放大镜、竹签、旧报纸、橡皮筋。材料三、三、试管滤纸培养法试管滤纸培养法（1）每管内加入冷开水约）每管内加入冷开水约2ml。（2）将滤纸条沿长轴纵折，以保持挺直。）将滤纸条沿长轴纵折，以保持挺直。（3）用竹签取）用竹签取0.5g粪便，涂于滤纸中段，左右各留粪便，涂于滤纸中段，左右各留0.5cm，上端

9、留，上端留1cm，下端留约下端留约2cm空白，不涂粪便。空白，不涂粪便。（4）将涂布粪便的滤纸插入管中，但不应该接触管底，滤纸条插入管中）将涂布粪便的滤纸插入管中，但不应该接触管底，滤纸条插入管中的深度以的深度以水只接触纸条而不碰到粪便水只接触纸条而不碰到粪便为宜。为宜。（5）在培养管上贴上标签并写上受检者的姓名和编号。）在培养管上贴上标签并写上受检者的姓名和编号。（6）每）每3050管用橡皮筋扎住，上下均包以旧报纸，再用橡皮筋扎紧。管用橡皮筋扎住，上下均包以旧报纸，再用橡皮筋扎紧。步骤三、三、试管滤纸培养法试管滤纸培养法（7）将培养管置于）将培养管置于31温度中培养温度中培养4天，或置于天，

10、或置于2630温度中培养温度中培养68天。以保证所有幼虫都有足够的时间发育到感染期幼虫。天。以保证所有幼虫都有足够的时间发育到感染期幼虫。（8）分离幼虫：沿管壁加入）分离幼虫：沿管壁加入45温水温水，淹没滤纸上的粪便淹没滤纸上的粪便，1小时后用小时后用镊子取出滤纸条，弃去。镊子取出滤纸条，弃去。将培养管静置将培养管静置1小时小时，用吸管吸去上清液，用吸管吸去上清液，幼虫留于管底幼虫留于管底0.5ml或更少的水内。或更少的水内。（9）用放大镜）用放大镜(4以上以上)或解剖镜以侧照法检出沉淀物内有无活的幼虫。或解剖镜以侧照法检出沉淀物内有无活的幼虫。如有活的幼虫，可先将管底部浸于如有活的幼虫，可先

11、将管底部浸于50-60的热水内抑制活动。的热水内抑制活动。（10）将沉淀物置于低倍镜下）将沉淀物置于低倍镜下(1010)检查，为使可折光的幼虫易于观检查，为使可折光的幼虫易于观察，检查时要尽量缩小光圈减弱光线，如需详细辨认幼虫，可加上盖察，检查时要尽量缩小光圈减弱光线，如需详细辨认幼虫，可加上盖玻片，在高倍镜下玻片，在高倍镜下(4010)检查，必要时可用目镜测微计测量幼虫。检查，必要时可用目镜测微计测量幼虫。三、三、试管滤纸培养法试管滤纸培养法每份样本鉴定钩蚴每份样本鉴定钩蚴100条，不足条，不足100条，全部鉴定记数。发现条，全部鉴定记数。发现其他种类的线虫只记录虫种名不记数。其他种类的线虫

12、只记录虫种名不记数。如遇土壤污染，培养中可出现自由生活的线虫成虫和幼虫必须如遇土壤污染，培养中可出现自由生活的线虫成虫和幼虫必须与人体寄生虫的幼虫相鉴别。与人体寄生虫的幼虫相鉴别。若若幼虫蠕动过快，难于观察，可用以下方法制动幼虫蠕动过快，难于观察，可用以下方法制动1)将载玻片放在将载玻片放在90的热水上用热气熏的热水上用热气熏2)从一侧加从一侧加3%5%福尔马林一滴福尔马林一滴3)加入加入1：4000的稀碘液一滴的稀碘液一滴要求注意事项三、三、试管滤纸培养法试管滤纸培养法钩蚴鉴别钩蚴鉴别美洲钩虫低倍镜下食管矛明显高倍镜下尾部鞘膜横纹明显十二指肠钩虫低倍镜下食管矛不不明显高倍镜下尾部鞘膜横纹不不

13、明显美洲钩虫美洲钩虫鞘膜横纹鞘膜横纹食管矛食管矛十二指肠钩虫十二指肠钩虫三、三、试管滤纸培养法试管滤纸培养法四、土壤中钩蚴分离改良方法四、土壤中钩蚴分离改良方法1 材料材料圆形分样筛（圆形分样筛（20目，直径目，直径15cm）、塑料烧）、塑料烧杯（杯（500ml）、棉纸、搪瓷盘或不锈钢脸）、棉纸、搪瓷盘或不锈钢脸盆（底面稍大于圆形分样筛的底面）、三盆（底面稍大于圆形分样筛的底面）、三角量杯（角量杯（500ml）、平皿（直径）、平皿（直径9cm）、土）、土铲、量筒、大镊子、记号笔、保鲜袋、温铲、量筒、大镊子、记号笔、保鲜袋、温箱（或水浴箱）、温度计、自来水、氯化箱（或水浴箱）、温度计、自来水、氯

14、化钠（钠（Nacl）、解剖镜、显微镜。）、解剖镜、显微镜。四、土壤中钩蚴分离改良方法四、土壤中钩蚴分离改良方法2 步骤2.1用土铲取表层2-3 cm土样，在500 ml塑料烧杯中定量至300 ml刻度处（约350 g）后放入保鲜袋，注明土样编号，并在登记本上注明相应的取样点、种植物类型、户主姓名等基本信息。2.2在圆形分样筛网面上铺上3层棉纸（棉纸直径22 cm），倒入样本土，用大镊子将颗粒较大的土压细、去除石子、草等杂质后，将土铺展均匀。2.3将放入土样的分样筛放入搪瓷盘中，并在搪瓷盘中加入45、5%的盐水，至盐水的液面没过筛网面的棉纸为止。2.4将加入盐水和土样分样筛的搪瓷盘置45温箱或水

15、浴箱中，放置1.5 h。2.5取出分样筛，将搪瓷盘中的水倒入三角量杯，自然沉淀15 min。2.6缓缓弃去上清液（倾倒过程不要让水回流），底部留50 ml或更少的液体。2.7将沉淀倒入平皿，解剖镜下进行初步鉴别后，显微镜下进行十二指肠钩虫钩蚴和美洲钩虫钩蚴的鉴别和计数。四、土壤中钩蚴分离改良方法四、土壤中钩蚴分离改良方法四、土壤中钩蚴分离改良方法四、土壤中钩蚴分离改良方法3 注意事项3.1土样应在早上10点前采集完毕。3.2采集的土样在近一段时间内没有喷过杀虫剂。3.3如果分离后沉淀中有絮状沉淀不便观察，建议再采取以上分离步骤，在45、5%的盐水中分离20 min后进行观察。1 取土样取从土表

16、至表层以下2cm处泥土；2 土样处理2.1 取回土样，剔除菜叶、树皮等大杂物，压碎土样中的大颗粒；2.2过筛 先后用孔径3mm的铜筛和孔径为2mm的铜筛过筛，收集过筛后的土样。五、土壤中人蛔虫卵检查及活力测五、土壤中人蛔虫卵检查及活力测定方法定方法五、土壤中人蛔虫卵检查及活力测五、土壤中人蛔虫卵检查及活力测定方法定方法3 取2支50ml大离心管，各放入过筛后的土样10g，加5%氢氧化钠溶液至40或45ml刻度线。4 用橡皮塞紧塞管口，用力振摇数分钟，充分混合后，以2000rpm,离心4min。5 弃去上部的氢氧化钠，加入饱和硝酸钠溶液搅拌混匀，2000rpm离心4min。6 离心后，再加饱和硝

17、酸钠溶液满至管口，静置15min。7 用一次性滴管吸取管口表层液面，滴加于离心管内，待下一步活力测定。六、六、 猪体囊尾蚴检测方法猪体囊尾蚴检测方法一、设备和材料显微镜、目镜测微尺、37C孵箱、方盘、解剖刀、解剖剪、解剖针、眼科镊、培养皿、载玻片、盖玻片、标本瓶、滴管、废物盘二、试剂生理盐水、猪胆汁。六、六、 猪体囊尾蚴检测方法猪体囊尾蚴检测方法三、检测方法 猪囊尾蚴寄生猪活动较多的肌肉，以臀股部肌肉最多，其后依次为舌肌、脑组织以及心肌。通过肉眼可直接查看到肌肉内有米粒大至豌豆大的白色半透明的囊泡。用镊子取出囊泡，置于生理盐水孵化，囊尾蚴头节外翻，压片后在低倍显微镜下观察头节，头节的四周可有4个吸盘和2圈小钩。“米猪肉”六、六、 猪体囊尾蚴检测方法猪体囊尾蚴检测方法1 采样采集猪的一侧臀股部肌肉1000 g，用刀每隔810 mm横断切开肌肉纤维，观察有无乳白色透明石榴籽样物的囊泡，取下囊泡置入盛有生理盐水的标本瓶中，待镜检鉴定。2 镜检将检获的囊泡用解剖针剥离去掉纤维膜，放入盛有20%猪胆汁生理盐水的平皿中，置于37C孵箱30 min，待头节翻出后压片镜检，观察其形