生物微生物的纯种分离与培养技术

1、实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等

2、条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨303712土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号2857土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂283035面肥

3、或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖283023细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2牛肉膏蛋白胨303712实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。4.5 mL无菌水试管(每人57支)。 4. 其他物品 无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药

4、勺，橡皮头，10%酚溶液。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化（一）系列稀释平板法1. 取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取210cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取1015g，称重后经105烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。

5、实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，稀释过程见图2-1。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-1 稀释分离过程示意图 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土

6、壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化3. 接种 分离不同的微生物类群采用不同的稀释度，参考表2-1进行选择。 从稀至浓分别吸取各浓度稀释液1mL于各平皿中（每个稀释度每种做2-3个培养皿，并注意做好浓度及培养基种类标记），同时做空白对照，倒入熔化后冷却至4550左右的相应培养基，见图2-2，轻轻地摇动并旋转平皿，使菌悬液与培养基混合均匀，水平静置待凝，倒置于相应温度的培养箱中培养，25天后，观察菌落情况及计数。实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-2 稀释分离无菌操作图 1.包装纸套中取出无

7、菌移液管；2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管；3.火焰旁取出土壤悬浮液；4.灼烧试管口及移液管吸液口；5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从最小稀释度开始，将稀释液加入无菌培养皿中；8.将融化冷凉至4550培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化4. 培养 冷凝后，将平板倒置于在各自适宜的温度下培养，培养一定时间后观察。5. 计数 选菌落单个分散、菌落数适量且各平行皿数量接近的稀释度的平皿计数。通常细菌和放线菌选

8、取菌落数在30300之间的平皿，霉菌选菌落数在10100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数，记录于表2-2。1%同一稀释度的平均菌落数稀释倍数每克干土含菌数=土壤含水量实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化表2-2 样品中四大类微生物的菌落数 稀释度菌落数类别采样日期采样地点10-210-310-410-510-6平均每克样品所含微生物数细 菌放线菌酵母菌霉 菌实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化（二）涂布法分离（酵母菌定量分离用） 依前法向

9、无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至4550的马铃薯葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取三个不同稀释度菌悬液0.1mL，依次滴加于相应编号已制备好的马铃薯葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破(图2-3)。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-3 涂布操作示意图 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分

10、离与纯化及霉菌的分离与纯化（三）平板划线法 取各平板一只做好标记，将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸一环10-2土壤稀释液，按图2-4和图2-5的方式在培养基表面轻轻划线，注意勿划破琼脂。划线完毕，将培养基倒置培养，25天后，挑取单个菌落，并移植于斜面上培养。如果只有一种菌生长，即得纯培养菌种。如有杂菌，可取培养物少许，制成悬液，再做划线分离，有时要反复几次，才能得到纯种。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-4 划线分离图 图2-5 划线分离示意图 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线

11、菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化（四）平板菌落形态及个体形态观察 从不同平板上选择不同类型菌落观察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。再用接种环挑取不同菌落，在显微镜下进行个体形态观察。将所分离的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态记录于表2-3。（五）分离纯化菌株转接斜面（斜面接种） 在分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好的菌落各挑选一个用接种环接种斜面，见图2-6。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化表2-3 各类菌株的主要菌落特征和细胞形态 菌株编号分离培养基菌落特征

12、细胞形态细 菌12放线菌12酵母菌12霉 菌12实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-6 斜面接种技术 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化 将细菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，霉菌接种于马丁氏培养基，酵母菌接种于马铃薯葡萄糖斜面上。 贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及菌苔特征于表2-4。置冰箱保藏。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉

13、菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化表2-4 四大类微生物斜面培养条件及菌苔特征 微生物培养基名称培养温度培养时间菌苔特征纯化程度细菌放线菌酵母菌霉菌实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化五、实验报告1. 简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。2. 将所检测样品中四大类微生物的菌落数填入表2-2。 3. 将所检测样品中各类菌株的主要菌落特征和细胞形态填入表2-3。 4. 记录斜面培养条件及菌苔特征（包括纯化结果）于表2-4。 返回实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与

14、纯化 一、实验目的1. 学习土壤中采样、富集培养、分离纯化硝化细菌。2. 学习硅胶平板制备，了解培养硝化细菌的培养基制备和培养方法。二、实验原理 硝化细菌是化能自养菌类群中主要类群之一。包括亚硝化细菌和硝化细菌(或称亚硝酸氧化细菌)两个亚群。 培养硝化菌的温度，因菌源而异，从中温环境下分离的菌株，最适生长温度为2628，从高温环境下分离的菌株，40下生长良好。实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 三、实验材料 1. 菌源土样 合成氨车间周围和堆放合成氨场地周围土样。 2. 培养基 硝化细菌增殖培养基，硝化细菌分离培养基（见附录），牛肉膏蛋白胨培养基，马丁

15、培养基，马铃薯葡萄糖培养基。3. 试剂 格里斯氏试剂（亚硝酸盐试剂），二苯胺硫酸试剂（硝酸盐试剂），见附录。4. 其他物品 无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，无菌微口滴管，无菌玻璃涂棒，透析袋，比色板，培养箱等。 实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 四、实验内容1. 采样 采集土样，选合成氨车间和堆放合成氨场地周围土样。2. 富集培养 称取土样1 g，接入到盛有20 mL硝化细菌增殖培养液的250 mL锥形瓶中，28振荡培养1014d，每隔几天在白磁板上分别加23滴格里斯氏试剂及二苯胺-硫酸试剂，然后用无菌滴管取出1滴增殖培养液的培养物加于上面两试剂中，

16、搅和均匀。检查增殖培养液中NO2-的减少（溶液由红色、粉红色变为无色）和NO3-的形成（NO3-氧化二苯胺的特有反应，溶液由无色变为深蓝色）。实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 3. 分离纯化 取富集培养液，通CO2气体30 min，然后静置30 min，再通过硅胶平板分离法进行分离纯化。 制取硅胶平板 取等体积的盐酸(HCl比重1.09)和硅酸钠(比重1.10)溶液，徐徐加入，缓慢混合，均匀搅拌，分装于100200mL透析袋中，蒸馏水中透析48 h，其间换蒸馏水68次，待透析袋内的硅酸钠溶液无色透明后，高压蒸汽灭菌或过滤除菌。吸取预先配制并已灭菌的硝

17、化细菌分离培养基1mL、硅酸钠溶液10mL于无菌培养皿内，静置片刻，待凝固后即可使用。 实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 硅胶平板分离 采用涂布分离法。取0.10.2mL富集培养液滴于510个硝化细菌分离培养基硅胶平板上，涂布分离。然后将硅胶平板放在盛有少量水的干燥器里(防止水分蒸发，避免硅胶平板干裂)，于28恒温下培养34周，当硅胶平板上出现硝化细菌极小的菌落后(多数菌落小于100m)，挑取1020个单菌落，分别接种到硝化细菌增殖培养液中，28恒温下培养34周，依前述方法检验NO2-及NO3-。 实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化

18、能自养微生物的分离与纯化 4. 纯度检查 硝化细菌培养过程常会有异养型细菌伴生，所以必须用多种有机营养培养基检查培养物是否有异养菌污染。常用的有机营养培养基是：牛肉膏蛋白胨培养基检查异养型细菌，马丁氏琼脂培养基检查霉菌，马铃薯葡萄糖培养基检查酵母菌。5. 镜检 对分离纯化的硝化细菌进行镜检及革兰氏染色。常见的硝化细菌特征见表2-5所示。 实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 表2-5 常见的硝化细菌 属细胞形态鞭毛革兰氏染色结果硝化杆菌属短杆状、梨形或球形单鞭毛，通常不运动G-硝化球菌属球形偏端鞭毛，运动G-硝化刺细菌属细长直感状、球形不运动G-实验实验

19、2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 五、实验报告1. 记录硝化细菌的分离方法及培养条件于下表2-6。 2 .分离、纯化硝化细菌菌株的记录于表2-7。 表2-6硝化细菌分离方法及培养条件 样品来源分离方法稀释度培养基名称培养温度培养条件实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 表2-7分离、纯化硝化细菌菌株的记录 菌株编号分离培养基菌落特征镜检结果返回实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 一、实验目的1.了解厌氧微生物的生长特性；2.观察厌氧微生物（产甲烷菌）的形态特征；3.掌握亨氏厌氧技术分离产甲烷细

20、菌的方法。二、实验原理 本实验所使用的亨盖特滚管技术，就是把适当稀释度的产甲烷细菌富集培养物，在无氧条件下接入含灭菌琼脂培养基的厌氧试管中，然后将它在滚管机上或者冰盘中均匀滚动，使含菌培养基均匀地凝固在试管内壁上。实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 三、实验材料1. 菌源样品 沼液。2. 培养基 产甲烷菌分离培养基（固体和液体）若干试管，培养基的配方见附录。3. 灭菌的厌氧试剂 硫化钠(1%)+碳酸氢钠(5%)混合试剂，20.5乙酸钠，25%甲酸钠，50%甲醇。4. 器材 高纯度的氮气，氢气和二氧化碳，氧装置一套，水浴锅，无菌毛细管，试管架，滚管机，冰块，lmL灭菌注

21、射器若干，旋涡混合器l台。 实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 四、实验方法1. 富集培养 在已灭菌的液体培养管中用lmL灭菌注射器加入1%硫化钠和碳酸氢钠混合试剂0.1mL，加入青霉素液0.1mL，加入乙酸钠、甲酸钠、甲醇各0.lmL，然后接入分离物lg。置35下振荡培养1015d。2. 熔化好装有固体培养基的培养管，排列在水温为5060的水浴锅中的试管架上，每一分离对象排列6支，每列前放一支同样组分、仅缺少琼脂的液体培养基。实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 3. 在每支琼脂培养管中，用lmL注射器分别加入硫化钠(1%)和碳酸氢钠(5%)

22、混合试剂0.1mL、青霉素液0.1mL、乙酸钠0.lmL、甲酸钠0.1mL、甲醇0.1mL。4. 把加富培养物在旋涡混合器上将絮状物打散。5. 用lmL灭菌注射器以氮气流洗去氧后，吸取0.1mL样品，迅速注入第一支液体培养基中，此管立即在旋涡混合器上混匀，然后换1支注射器取0.5mL注入第二支琼脂培养管中，依此稀释。每次稀释后均应混匀。一般稀释至10-6。稀释时，每做一个稀释度都要更换1支注射器。 实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 6. 在滚管机水槽中加入冰块，并加入冷水。水位加至滚轴下线浸没冰块约23mm，使在滚轴转动时冰水在滚轴上形成一层均匀水膜。冰块加入量使滚

23、管过程中水温保持在较低温度，能使培养管中琼脂培养基迅速凝固。7. 启动滚管机，调节滚轴转速(6080r/min)，将上述稀释的琼脂培养管平稳放在滚轴与支托点之间，任意均匀转动。待琼脂培养基在培养管内壁凝固成均匀透明的琼脂薄膜为止。若无滚管机，可在一瓷盘中加水和冰块(为降低温度还可加少量食盐)，用手滚管。 实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 8. 如以二氧化碳为基质，滚管后用氢气置换氮气。再注入二氧化碳。30mL的厌氧培养管中注入6mL二氧化碳，或直接以氢和二氧化碳混合气体(5l体积比)进行换气。9. 滚管后放置于3537培养，约l015d后可见细小菌落出现。但以乙酸盐

24、为基质的产甲烷菌菌落出现所需时间较长。10. 按亨氏厌氧操作法，用无菌毛细管挑取单菌落转液体培养基进行厌氧培养。在荧光显微镜下镜检单菌落培养物。产甲烷菌菌体有自发荧光，在荧光显微下菌体呈现黄绿色。如不纯，应做进一步的滚管分离，直至获得纯培养体。 实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 五、实验报告 .记录产甲烷菌的分离方法及培养条件于下表2-8。2 .荧光显微镜下镜检单菌落培养物的记录于表2-9。表2-8 产甲烷菌分离方法及培养条件 样品来源分离方法培养基名称培养温度培养条件实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 表2-9 荧光显微镜下镜检单菌落培养

25、物的记录 菌落编号自发荧光有无菌落特征镜检菌体颜色实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，稀释过程见图2-1。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-1 稀释分离过程示意图 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化（三）平板划线法 取各平板一只做好