《原生质体融合》ppt课件

1、一、原生质体分别一、原生质体分别二、原生质体分别及纯化操作二、原生质体分别及纯化操作三、原生质体培育三、原生质体培育四、体细胞杂交原生质体交融四、体细胞杂交原生质体交融五、原生质体的遗传饰变五、原生质体的遗传饰变第三节、植物原生质体技术及运用第三节、植物原生质体技术及运用体细胞杂交研讨历程及普通概念体细胞杂交研讨历程及普通概念体细胞杂交的普通流程体细胞杂交的普通流程杂交细胞的鉴定杂交细胞的鉴定 123 细胞杂交的运用细胞杂交的运用4一体细胞杂交的含义及研讨历程一体细胞杂交的含义及研讨历程概念：不同亲本种间或属间等的原生质体，在人概念：不同亲本种间或属间等的原生质体，在人工诱导下，相互接触，从而

2、发生膜交融、胞质交融、工诱导下，相互接触，从而发生膜交融、胞质交融、核交融并构成杂种细胞，经过培育进一步发育成杂种核交融并构成杂种细胞，经过培育进一步发育成杂种植株。这一过程称为原生质体交融或细胞杂交。植株。这一过程称为原生质体交融或细胞杂交。使植物无性杂交成为能够使植物无性杂交成为能够使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实缘杂种成为现实突破了物种间的界限突破了物种间的界限原生质体交融的意义原生质体交融的意义植物体细胞杂交的几个重要进展植物体细胞杂交的几个重要进展1960年年 Kocking用酶法制备高等植物原生质体初次获得胜用酶法制

3、备高等植物原生质体初次获得胜利；利；1971年年 Takebe初次从离体烟草原生质体培育中获得再生完初次从离体烟草原生质体培育中获得再生完好植株；好植株；1972年年 Carlson初次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，初次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种；这是第一个植物体细胞杂种；1974年年 Kao将聚乙二醇将聚乙二醇PEG诱导交融法运用于植物细诱导交融法运用于植物细胞交融并建立了相应的交融技术；胞交融并建立了相应的交融技术；1978年年 Melchers获得第一个属间体细胞杂种番茄马铃获得第一个属间体细胞杂种番茄马铃薯；薯；1981年年 Zimmerman发明了

4、电交融仪，并初次提出了电交融发明了电交融仪，并初次提出了电交融概念；概念；1987年年 Schweiger建立了单对原生质体电交融技术程序。建立了单对原生质体电交融技术程序。 二植物细胞交融的程序：二植物细胞交融的程序： 原生质体分别的分别、纯化原生质体分别的分别、纯化 交融方法选择交融方法选择 杂种细胞的挑选杂种细胞的挑选 愈伤组织构成、分化植株再生愈伤组织构成、分化植株再生 杂种植物的鉴定杂种植物的鉴定原生质体交融的方法原生质体交融的方法聚乙二醇聚乙二醇 PEG化学方法化学方法电脉冲电脉冲物理方法物理方法生物方法生物方法仙台病毒仙台病毒(Sendai virus)NaNO3处置处置高高pH

5、-高浓度高浓度Ga2+飞秒激光诱导交融飞秒激光诱导交融电交融电交融空间细胞交融空间细胞交融1电交融法：指利用改动电场诱导原生质体彼此相电交融法：指利用改动电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，到达原生质体交融的方法。性电击穿，到达原生质体交融的方法。电交融特点：电交融特点： 效率高效率高 对原生质体损伤性小对原生质体损伤性小 对交融细胞数易于控制对交融细胞数易于控制方法：微电极法和双向电泳法方法：微电极法和双向电泳法双向电泳法：经过电泳，双向电泳法：经过电泳，两细胞膜严密接触，且膜两细胞膜严密接触，且膜外表的蛋白

6、质分子分别，外表的蛋白质分子分别，产生了无蛋白的类脂区。产生了无蛋白的类脂区。电交融仪电交融仪Fusion phases of oat燕麦燕麦protoplasts (Avena sativa)微电极法：指利用改动电场诱导原生质体彼此微电极法：指利用改动电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，到达原生质体交融的方法。生可逆性电击穿，到达原生质体交融的方法。实践操作：先把待交融的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中构成项链状陈列；微电极法：微电极法：再用再用15V/cm15V/c

7、m直流电脉冲直流电脉冲/ /微秒冲击细胞或原生质体的微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解呵斥假设干微孔，于是在膜之间粘接点，细胞膜降解呵斥假设干微孔，于是在膜之间构成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细构成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的构成。胞的构成。1、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此接近；此接近；2、两个相邻原生质体之间的质膜相互交融，随后、两个相邻原生质体之间的质膜相互交融，随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在交融后的质膜上重新分布；脂等成分也在交融

8、后的质膜上重新分布；3、细胞质发生交融；、细胞质发生交融；4、细胞核发生交融，构成单核交融细胞。、细胞核发生交融，构成单核交融细胞。交融过程：交融过程：2聚二乙醇聚二乙醇 诱导交融法诱导交融法 PEGPEG交融的机理：交融的机理：PEGPEG分子具有细微的负极性，与具有正极性基团的水、分子具有细微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等构成氢键。蛋白质和碳水化合物等构成氢键。当当PEGPEG分子链足够长时，它在相邻原生质体外表之间有分子链足够长时，它在相邻原生质体外表之间有分子桥、改动膜外表物理化学性质和添加类脂膜流动分子桥、改动膜外表物理化学性质和添加类脂膜流动性作用，引发原生质

9、体的粘连。性作用，引发原生质体的粘连。当当PEGPEG分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导致原生质体交融。致原生质体交融。PEGPEG的选用：普通选择相对分子质量为的选用：普通选择相对分子质量为40004000获获60006000PEG PEG 对细胞有毒害作用，用离子对细胞有毒害作用，用离子交换树脂纯化可消除其对细胞的交换树脂纯化可消除其对细胞的毒害作用。毒害作用。优点：本钱低、不需求特殊的设优点：本钱低、不需求特殊的设备；交融子产生的异核率高；交备；交融子产生的异核率高；交融过程不受物种限制融过程不受物种限制缺陷：交融过程繁琐、缺陷：交融过程

10、繁琐、PEG能能够对细胞呵斥毒害够对细胞呵斥毒害PEG交融所需试剂 交融液：交融液：pH 5.6 CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇甘露醇或山梨醇 0.51.0mol 诱导液：交融液诱导液：交融液PEG 2045 稀释液：稀释液： A液液g/100mlpH6.0 B液液 (g/100ml) pH10.5 葡萄糖葡萄糖 7.21 甘氨酸甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169P1P2P1 P2混合静止混合静止1 min.融融 合合交融液交融液参与参与PEG稀稀 释释洗洗 涤涤参与稀释液参与稀释液参与培育基参与培育基培

11、培 养养选选 择择PEG法的流程法的流程P1P2P1 P2融融 合合交融液交融液稀稀 释释洗洗 涤涤培培 养养选选 择择 盐类交融剂种类盐类交融剂种类 硝酸盐类：硝酸盐类：NaNO3NaNO3、KNO3KNO3、Ca(NO3)2Ca(NO3)2 氯化物类：氯化物类：NaClNaCl、CaCl2 CaCl2 、MgCl2 MgCl2 、 BaCl2BaCl2 葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠酸钠 盐类交融的优缺陷盐类交融的优缺陷 优点：盐类交融剂对原生质体的活力破坏力优点：盐类交融剂对原生质体的活力破坏力小小 缺陷：交融频率低，对液泡化兴隆的原生质

12、缺陷：交融频率低，对液泡化兴隆的原生质体不易诱发交融体不易诱发交融3 3盐类交融法盐类交融法4 4高高Ca2+Ca2+和高和高pHpH值交融值交融 Ca2+浓度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5取分别、纯化好的两种亲本原生质体以取分别、纯化好的两种亲本原生质体以1:11:1的比例混合的比例混合; ;参与参与0.05mol/LCaCl2.2H2O0.05mol/LCaCl2.2H2O和和0.4mol/L0.4mol/L甘露醇甘露醇; ;再用甘氨酸钠缓冲调理再用甘氨酸钠缓冲调理pHpH值到值到10.510.5，成为交融液，同时，成为交融液，同时在在3737下保温下保温0.5h;0.5h

13、;用用0.4mol/L0.4mol/L甘露醇洗净高甘露醇洗净高CaCl2CaCl2和高和高pHpH值；值；两种原生质体的交融率到达两种原生质体的交融率到达10%10%。5 5生物诱导交融法生物诱导交融法仙台病毒法仙台病毒法 仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多形性颗粒，直径为形性颗粒，直径为5060 nm，由两层磷脂组成的外膜包裹，由两层磷脂组成的外膜包裹着着RNA和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是HANA蛋白质，一种是蛋白质，一种是F蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血蛋白质，前者具有神经

14、氨酸酶和血凝活性分子量较大，后者具有交融和溶血作用分子量凝活性分子量较大，后者具有交融和溶血作用分子量较小。较小。 诱导细胞交融的机理：病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜诱导细胞交融的机理：病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜外表的糖蛋青丝生相互作用，从而使两个细胞可以相互接触，外表的糖蛋青丝生相互作用，从而使两个细胞可以相互接触，在电镜下察看到在相接触的相邻细胞外表之间将产生一些微在电镜下察看到在相接触的相邻细胞外表之间将产生一些微小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积也在添加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一同了，构成细也在添加，最

15、后相邻细胞的细胞质就结合在一同了，构成细胞凝集块再经过膜上蛋白质分子的重新陈列，使膜中脂类分胞凝集块再经过膜上蛋白质分子的重新陈列，使膜中脂类分子重排而翻开质膜，最后导致细胞交融。子重排而翻开质膜，最后导致细胞交融。 利用仙台病毒诱导细胞交融的步骤：利用仙台病毒诱导细胞交融的步骤：1先将亲本细胞待交融的细胞分别制成悬浮液、先将亲本细胞待交融的细胞分别制成悬浮液、 混合离心；混合离心；2将堆积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在将堆积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在4oC低温下摇动低温下摇动20分钟，使细胞构成凝集块；分钟，使细胞构成凝集块；3再将温度升至再将温度升至37oC，间歇摇动，间歇摇动30

16、分钟，使其交分钟，使其交融；融；4洗去病毒，将交融细胞浮于选择性培育基进展培洗去病毒，将交融细胞浮于选择性培育基进展培育。育。 由于由于4oC低温利于细胞聚集，在交融时需求提高低温利于细胞聚集，在交融时需求提高温度，否那么交融不会发生。温度，否那么交融不会发生。2.2.细胞交融的类型细胞交融的类型根据交融时细胞的完好程度，原生质体交融分为两大根据交融时细胞的完好程度，原生质体交融分为两大类：对称交融和非对称交融类：对称交融和非对称交融对称交融：两个完好的细胞原生质体的交融对称交融：两个完好的细胞原生质体的交融非对称交融：利用物理或化学的方法使某一亲本的非对称交融：利用物理或化学的方法使某一亲本

17、的核或细胞质失活后再进展交融。交融的结果是获得核或细胞质失活后再进展交融。交融的结果是获得非对称杂种，即两交融亲本对杂种细胞的遗传组成非对称杂种，即两交融亲本对杂种细胞的遗传组成的奉献是不对等的。的奉献是不对等的。3 3 杂种细胞的选择杂种细胞的选择 互补选择：互补选择： 双荧光标志选择法：双荧光标志选择法： 机械选择法：机械选择法：互补选择：利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，互补选择：利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，在特定培育条件下，只需发生互补作用的杂种细胞在特定培育条件下，只需发生互补作用的杂种细胞才干生长的选择方法。才干生长的选择方法。互补选择方法：互补选择方法： A、白化互补选

18、择法、白化互补选择法 B、营养缺陷型互补选择、营养缺陷型互补选择 C、抗性互补选择、抗性互补选择 D、代谢互补抑制选择、代谢互补抑制选择 A、白化互补选择法、白化互补选择法以矮牵牛为例：以矮牵牛为例：白化苗原白化苗原生质体生质体1白化苗原白化苗原生质体生质体2杂种细胞杂种细胞限定培育基限定培育基绿色愈伤组织绿色愈伤组织或幼苗杂种或幼苗杂种交融交融B、营养缺陷型互补选择、营养缺陷型互补选择Gly-型细胞型细胞Pro-型细胞型细胞交融交融Gly-、Pro-培育基培育基杂种细胞杂种细胞培育培育C、抗性互补选择、抗性互补选择抗抗A不抗不抗B型细胞型细胞抗抗B不抗不抗A型细胞型细胞交融交融含含A、B培育

19、基培育基杂种细胞杂种细胞D、温度敏感型选择、温度敏感型选择耐高温不耐高温不耐低温型耐低温型细胞细胞耐低温不耐低温不耐高温型耐高温型细胞细胞交融交融高温下培育高温下培育低温下培育低温下培育杂种细胞杂种细胞机械选择法：机械选择法： 利用天然存在或是人为呵斥的两个利用天然存在或是人为呵斥的两个亲本在物理特性上的差别即可见标志，进展挑选。亲本在物理特性上的差别即可见标志，进展挑选。利用或人为的呵斥细胞生长或分化才干上的差别进利用或人为的呵斥细胞生长或分化才干上的差别进展挑选。展挑选。做法：在倒置显微镜下，用微管将交融细胞汲取出做法：在倒置显微镜下，用微管将交融细胞汲取出来进展培育的方法。来进展培育的方

20、法。双荧光标志选择法：运用两种不同的荧光染料给双亲双荧光标志选择法：运用两种不同的荧光染料给双亲原生质体染上不同的颜色，然后借助不同的荧光标志，原生质体染上不同的颜色，然后借助不同的荧光标志，在显微镜下进展挑选。在显微镜下进展挑选。无叶绿体的无叶绿体的原生质体原生质体含叶绿体的含叶绿体的原生质体原生质体FITC标志标志苹果绿苹果绿荧光荧光红色红色荧光荧光荧光显荧光显微镜微镜杂种杂种细胞细胞异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素FITC异硫氰酸罗丹明异硫氰酸罗丹明RITC三三 杂种植株的再生和鉴定杂种植株的再生和鉴定植物原生质体交融及再生植株过程植物原生质体交融及再生植株过程杂种植株的鉴定方法：杂种植株的

21、鉴定方法：1 1杂种植物形状特征、特性鉴定杂种植物形状特征、特性鉴定2 2杂种植物的核型分析杂种植物的核型分析3 3同工酶分析同工酶分析4) 4) 分子标志鉴定：分子标志鉴定：RFLPRFLP、AFLPAFLP、SSRSSR、ISSR ISSR 、RAPDRAPD标志鉴定标志鉴定形状学鉴定形状学鉴定 形状标志即植物的外部特征，如花的外形及颜形状标志即植物的外部特征，如花的外形及颜色、果实色、果实(种子种子)的外形及颜色、叶型、表皮毛、株的外形及颜色、叶型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及对疾病的抗性等。型、穗型、千粒重、耐逆性以及对疾病的抗性等。形状标志简单直观，但是标志少、多态性差、易

22、受形状标志简单直观，但是标志少、多态性差、易受环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为数量性状，由几个位点控制，表现为一个范围，而数量性状，由几个位点控制，表现为一个范围，而不是简单的性状差别。不是简单的性状差别。杂种植物的核型分析杂种植物的核型分析 细胞标志主要包括染色体核型细胞标志主要包括染色体核型(染色体数目、染色体数目、大小、随体、着丝点位置等大小、随体、着丝点位置等)和带型和带型(C带、带、N带、带、G带等带等)。细胞学标志位点较少，而且对于亲缘关。细胞学标志位点较少，而且对于亲缘关系较近的物种，由于细胞学标志差别不明显，所系较近的物种

23、，由于细胞学标志差别不明显，所以很难根据细胞学特征来区分。以很难根据细胞学特征来区分。18条染色体条染色体36条染色体条染色体同工酶标志同工酶标志 同工酶为共显性，父本和母本的基因可以同时在同工酶为共显性，父本和母本的基因可以同时在后代中表达，不受环境要素影响，中仅有相对稳定后代中表达，不受环境要素影响，中仅有相对稳定; ;分析操作简便，所需资料较少分析操作简便，所需资料较少; ;缺乏之处是位点数较缺乏之处是位点数较少，植物少，植物10201020种同工酶表现出位点的多态性，覆盖种同工酶表现出位点的多态性，覆盖的基因组范围有限。的基因组范围有限。染色体原位杂交染色体原位杂交 染色体原位杂交染色

24、体原位杂交Genomic in situ hybridization，GISH是一项利用标志的是一项利用标志的DNA探针与染色体上的探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进展检测的分子标志技杂交，在染色体上直接进展检测的分子标志技术。通常用同位素或生物素、地高辛标志的术。通常用同位素或生物素、地高辛标志的DNA探探针与染色体针与染色体DNA杂交，经过放射自显影或经过抗原杂交，经过放射自显影或经过抗原抗体反响，在荧光显微镜下察看抗体反响，在荧光显微镜下察看DNA探针与其互补探针与其互补的的DNA序列结合的位置。最大优点是可以显示在体序列结合的位置。最大优点是可以显示在体细胞杂种中哪条染色体来

25、源于这个亲本，哪条染色细胞杂种中哪条染色体来源于这个亲本，哪条染色体来源于另一个亲本，因此更准确、直观。体来源于另一个亲本，因此更准确、直观。分子生物学标志分子生物学标志 植物的分子标志主要有植物的分子标志主要有RAPD、RELP、AFLP、SSR、ISSR等。等。四原生质体交融的运用四原生质体交融的运用植物体细胞杂交抑制了植物远源杂交不亲和的妨碍，植物体细胞杂交抑制了植物远源杂交不亲和的妨碍，在培育新种类方面具有宽广的运用前景。在培育新种类方面具有宽广的运用前景。目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻

26、、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新资料。育种上有用的新资料。 番茄番茄+ +马铃马铃薯薯19781978年德国科学家梅歇尔斯等人年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯把马铃薯(potato)(potato)和番茄和番茄(tomato)(tomato)的原生质体交融获得了体细胞杂的原生质体交融获得了体细胞杂种种“泡马豆泡马豆pomato)pomato)杂交株同杂交株同时具有马铃薯和番茄的一些形状时具有马铃薯和番茄的一些形状特征，但没有产生可结实的花、特征，但没有产生可结实的花、果实和真正意义上的块茎，