最新植物组织培养第六章植物细胞培养PPT文档

1、目的与要求目的与要求 第一节第一节 单细胞培养单细胞培养二、单细胞的分离二、单细胞的分离叶组织是分离单细胞的最好材料，1、机械法：叶片组织轻轻研碎，匀浆过滤或离心，得到纯化细胞。特点：细胞不受酶伤害，不会发生质壁分离。 不适用于所有植物2、酶解法：利用果胶酶处理叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。特点：必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞胀裂。第二节第二节 细胞悬浮培养细胞悬浮培养 在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株。适合悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法是：筛选细胞株的方法是：（1）从培养的愈伤组织中

2、挑选出外观疏松、生长快）从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织。的浅色愈伤组织。（2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。（3）接种在固体培养基上培养）接种在固体培养基上培养2周。周。（4）挑选生长快的细胞株并继代培养。）挑选生长快的细胞株并继代培养。（5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。一、培养类型和方法一、培养类型和方法（一）成批培养（一）成批培养 指把细胞分数在一定容积的指把细胞分数在一定容积的培养基中进行

3、培养，培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。化研究常用的培养方法。（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的养分为细胞耗尽为止。养分为细胞耗尽为止。（2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在培养基中的均匀分布。培养基中的均匀分布。（3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈）在整个培养过程中，细胞数目会不断

4、发生变化，呈现出明显的慢现出明显的慢-快快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。慢，最后增长停止的细胞生长周期。（4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。瓶里，继续进行培养。1、成批培养法、成批培养法n细胞生长周期延滞期对数增长期直线生长期缓慢期静止期时间 细胞数目（二）半连续培养（二）半连续培养 指每隔一定时间后倒出一半的悬浮

5、液，并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复地取得大量、均一的培养细胞，供生物研究之用。 是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。 在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。（三）连续培养（三）连续培养1、连续培养的特点（1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。（2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快。（3）适于大规模工业化生产。（三）连续培养2、连续培养的种类封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。 封闭型连续培养：

6、在培养过程中，排除的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间延长，细胞密度不断增加。开放型连续培养：为了不使限制细胞生长的因子出现，创造一个稳定的细胞生长的环境，必须建立一套自动控制系统来调节培养基注入的数量和培养液的总体积。在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞相当于培养系统中新细胞的增加数。3、为了保持在开放

7、连续培养中细胞增殖的稳定性，采取的控制方法：（1）浊度恒定法（2）化学恒定法二、悬浮细胞的继代在悬浮培养中，为了保持一定的悬浮细胞增殖速度和增殖量，应定期做继代培养，最适的周期一般为1-2周。但实际所需的时间和接种量应视不同细胞系而定。继代时间为1周的细胞系可用1：4的接种量，继代时间为2周的可用1：10的接种量。二、悬浮细胞的继代在悬浮培养中，细胞刚进入静止期之初，细胞悬浮液达到最大量，就必须进行继代培养。因为处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长会引起细胞的大量死亡和解体。为了加速细胞增殖，有的甚至在对数生长期末就进行继代。三、培养细胞的同步化同步培养：在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期

8、的各个阶段，同步性的程度以百分百分数表示。三、培养细胞的同步化实现悬浮培养细胞同步化的方法：1、饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在g1期或g2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同时进入分裂。三、培养细胞的同步化2、抑制法：使用dna合成抑制剂，也可使细胞培养同步化。当细胞受到这些化学药物处理后，由于这些核苷酸类似物的存在阻止了dna的合成，细胞周期只能进行到g1期，细胞都滞留在g1期和s期的边界，当把这些抑制剂除去后，细胞就进入同步分裂。 为了改善液体培养基中材料的通气状况，需进为了改善液体培养基中材料的通气状况

9、，需进行培养基的不断振荡：行培养基的不断振荡：（1）旋转培养）旋转培养（2）往返振荡培养）往返振荡培养（3）旋转振荡培养）旋转振荡培养（4）搅动振荡培养）搅动振荡培养四、培养基的振荡1、培养基成分：n6，ms，b5适合单子叶植物细胞，ms，b5，ls，sl适合双子叶植物细胞。条件培养基适合单细胞和低密度细胞培养。需要硝态氮、铵态氮、无机磷浓度更高。五、影响细胞培养的因素五、影响细胞培养的因素2、细胞密度：培养基的成分和起始细胞密度对单细胞培养成败有影响。起始密度：细胞培养最低的有效密度，即能使细胞分裂、增殖的最低接种量，低于这个密度细胞不能分裂，甚至很快解体死亡。五、影响细胞培养的因素五、影响

10、细胞培养的因素3、植物生长调节剂：细胞悬浮培养时，常表现一种自然的聚集现象，加入2，4-d，少量水解酶或酵母提取液，能够增加细胞的分散度。4、ph和二氧化碳浓度在悬浮培养时，ph变动相当大。加入edta使铁和其他金属离子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作为稳定ph的一种方法。二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中，二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用，第三节 植物细胞生长和活力的测定一、悬浮培养中细胞生长的测定1、细胞计数：把1份培养加入到2份8%三氯化铬溶液中，在70下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用血球计数板进行细胞计数。一、悬浮培养

11、中细胞生长的测定2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（pcv）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。3、细胞鲜重和干重：4、细胞有丝分裂的指数：在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。5、细胞植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数一、悬浮培养中细胞生长的测定第三节 植物细胞生长和活力的测定二、培养细胞活力的测定1、ttc法2、荧光素二乙酸法（fda法）3、伊凡蓝染色法第四节 植物细胞培养的应用一、植物次生代谢产物的生产一、植物次生代谢产物的生产二、突变体选择二

12、、突变体选择三、诱导多变体三、诱导多变体 （一（一）生产天然的植物成分）生产天然的植物成分 通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱合物，如生物碱、 抗菌剂、抗血平、橡胶、类抗菌剂、抗血平、橡胶、类固醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质固醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质. 一、植物次生代谢产物的生产一、植物次生代谢产物的生产 海巴戟的植物体内海巴戟的植物体内 蒽醌蒽醌 胡萝卜愈伤组织胡萝卜愈伤组织 紫红色、橙红色、绿色、黄白紫红色、橙红色、绿色、黄白色色4种愈伤种愈伤组织株系组织株系 紫草紫草 紫草色素紫草色素 长春花细胞和愈伤组织培养物长春花

13、细胞和愈伤组织培养物 利血平和阿马灵利血平和阿马灵 三七的愈伤组织培养物三七的愈伤组织培养物 三七皂苷（含量达干重三七皂苷（含量达干重的的10.25%） 三分三的愈伤组织中三分三的愈伤组织中 茛菪碱茛菪碱（含量可达干重的（含量可达干重的0.55% 一、植物次生代谢产物的生产一、植物次生代谢产物的生产 问题： 1.在很多情况下，有些细胞培养物不能产生天然化合物或者比正常的植株产量低 原因：（1）培养细胞与完整植株不同，培养的细胞缺少完整植株 所有的那种进行转化反应的能力 （2）对于能够促成这类天然产物合成的营养条件和其他培养条件缺乏了解 已知：在培养细胞中生物碱的产量受培养物的生长阶段、培养基成

14、分、培养条件（光照、温度）及细胞基因型等的影响。 问题： 2.细胞在遗传上的不稳定性 解决：对能够合成这些化合物的细胞进行不断的筛选，选择那 些稳产和高产的细胞系。（二）生产转化（二）生产转化 定义：利用生物系统通过水解、加氢、羟基定义：利用生物系统通过水解、加氢、羟基化作用、氧化还原及脂化反应，将有机分子转化作用、氧化还原及脂化反应，将有机分子转化为新的化合物的过程。化为新的化合物的过程。 方法：方法：（1）给细胞提供在一般情况下植物所）给细胞提供在一般情况下植物所不具备的底物化合物。不具备的底物化合物。 目的：得到自然界中不存在的化合物。目的：得到自然界中不存在的化合物。 （2）给细胞提供

15、植物天然产物中间体。）给细胞提供植物天然产物中间体。 目的：提高该种天然化合物在细胞中的产量。目的：提高该种天然化合物在细胞中的产量。 （三）细胞的工厂化生产（三）细胞的工厂化生产步骤：（步骤：（1）高产细胞株的选择）高产细胞株的选择 （2）“种子种子”培养培养 （3）细胞的规模培养）细胞的规模培养二、突变体选择二、突变体选择 突变体育种缺点：对多细胞有机体进行诱突变体育种缺点：对多细胞有机体进行诱变处理后会形成嵌合体变处理后会形成嵌合体 利用细胞培养进行突变体选择，多采用离利用细胞培养进行突变体选择，多采用离体的单倍体细胞，因为它能加强获得隐性突变体的单倍体细胞，因为它能加强获得隐性突变体的

16、机会。还可以在很小的空间操作千百万潜体的机会。还可以在很小的空间操作千百万潜在的植株。在的植株。 （1）直接选择法：适用于抗性变异的细胞选择）直接选择法：适用于抗性变异的细胞选择 方法：在培养基中加入某种对正常细胞有毒害方法：在培养基中加入某种对正常细胞有毒害的物质，当多数细胞死去以后，把少数能存活的物质，当多数细胞死去以后，把少数能存活的细胞系分离出来，转入含有同种毒素但浓度的细胞系分离出来，转入含有同种毒素但浓度更高的培养基上，进一步检验这些细胞系的突更高的培养基上，进一步检验这些细胞系的突变性质。变性质。二、突变体选择二、突变体选择（2）间接选择法（负选法）间接选择法（负选法） 适用于目

17、标表现型不具有选择上的优势，即细适用于目标表现型不具有选择上的优势，即细胞未产生某种抗性物质，而是产生了一种代谢形式胞未产生某种抗性物质，而是产生了一种代谢形式或表现形式的性状。或表现形式的性状。二、突变体选择二、突变体选择如：在抗氯酸盐细胞的选择中，分离出了硝酸还原美确实突变的如：在抗氯酸盐细胞的选择中，分离出了硝酸还原美确实突变的细胞系。细胞系。 硝酸还原酶可还原硝酸成亚硝酸，加入氯酸盐，硝酸还原酶硝酸还原酶可还原硝酸成亚硝酸，加入氯酸盐，硝酸还原酶也可还原氯酸盐成亚氯酸盐。也可还原氯酸盐成亚氯酸盐。 亚氯酸盐的毒性比氯酸盐高几百倍。亚氯酸盐的毒性比氯酸盐高几百倍。如果细胞含有硝酸还原酶，

18、在培养基中加入如果细胞含有硝酸还原酶，在培养基中加入20-80mmol/l氯酸氯酸盐，此浓度氯酸盐虽不足以杀活细胞，但氯酸盐可被还原成亚氯盐，此浓度氯酸盐虽不足以杀活细胞，但氯酸盐可被还原成亚氯酸盐，使这些细胞被杀死，存活下来的只有硝酸还原酶确实的突酸盐，使这些细胞被杀死，存活下来的只有硝酸还原酶确实的突变细胞。变细胞。二、突变体选择二、突变体选择 为了克服远缘杂种的不育性，常需要进行染色体数为了克服远缘杂种的不育性，常需要进行染色体数目的加倍。目的加倍。 若能通过染色体加倍而恢复其育性，就能使杂种在若能通过染色体加倍而恢复其育性，就能使杂种在育种工作中得到充分利用。采用细胞培养方法可以达到育

19、种工作中得到充分利用。采用细胞培养方法可以达到这个目的。这个目的。 利用培养过程中染色体的自发加倍现象，也可使单利用培养过程中染色体的自发加倍现象，也可使单倍体细胞加倍，获得纯合二倍体植株，在遗传育种上有倍体细胞加倍，获得纯合二倍体植株，在遗传育种上有重要意义。重要意义。三、诱导多倍体三、诱导多倍体第四节第四节 人工种子人工种子一、人工种子的概念及意义一、人工种子的概念及意义 定义：离体培养条件下的植物材料，通过繁殖获得定义：离体培养条件下的植物材料，通过繁殖获得大量的高质量的成熟胚状体，把这些胚状体外面包上大量的高质量的成熟胚状体，把这些胚状体外面包上有机化合物作为保护胚状体及提供营养的有机

20、化合物作为保护胚状体及提供营养的“种皮种皮”，从而创造出真种子类似的结构。从而创造出真种子类似的结构。 包括包括 ：细胞胚、人工胚乳、人工种皮：细胞胚、人工胚乳、人工种皮 第四节第四节 人工种子人工种子 分类分类：（：（1）裸露或休眠繁殖体）裸露或休眠繁殖体 （2）种皮包裹的繁殖体）种皮包裹的繁殖体 （3）水凝胶包裹的胚状体、不定芽等繁殖体）水凝胶包裹的胚状体、不定芽等繁殖体 （4）液胶包埋系统）液胶包埋系统优点：（1）使自然条件下不易结实或种子昂贵的材料能快速繁 殖和保存（2）繁殖速度快，以一个体积为12l的发酵罐计算，在二十几天内可产生胡萝卜体细胞胚1000万个（3）固定杂种优势，可使f1

21、杂种优势多代利用，使优良单株快繁成无性系而多代利用，保持杂种材料的遗传稳定性优点：（4）由于从任何材料都能得到胚状体，为基因工程技术应用于生产提供桥梁（5）在人工种子的制作中，加入各种营养成分或生长调节剂，调节植物生长，提高植物抗逆性（6）常规种子繁殖每年消耗大量粮食供播种，人工种子在一定程度上可取代天然种子而节约粮食，同时人工种子体积小，贮运方便，而且可以像天然种子那 样播种育苗。（一）胚状体的诱导（胡萝卜） 将胡萝卜天然种子表面消毒，在无菌条件下发芽成无菌苗切割下胚轴或子叶接种在含2,4-d0.51.5mg/l的ms培养基上诱导胚性愈伤组织将胚性愈伤组织悬浮在培养基中，诱导产生体细胞胚每710d更换一次培养液，震荡培养