质量分析方法验证中检出限和定量限测定方法探讨_鲁静

1、Drug Standards of China 2012,Vol.13No.1中国药品标准2012年第13卷第1期33作者简介:鲁静,主任药师;研究方向:中药及天然药质量控制。Tel E-mail :lujing 方法学研究质量分析方法验证中检出限和定量限测定方法探讨鲁静1,付凌燕2,王旭3(1.中国食品药品检定研究院,北京100050;2.吉林省吉林市食品药品检验所,吉林132000; 3.国家药典委员会,北京100061摘要分析、比较了IUPAC ,ICH 及国内其他分析检测领域关于检出限和定量限的概念和测定方法,试验比较了几种测定方法的差异,可为中药质量分析方

2、法验证中检出限和定量限的测定方法提供参考。关键词:检出限;定量限中图分类号:R921.2文献标识码:A文章编号:10093656(20121333Discussion on the Detecting Methods for Limit of Detection and Limit of Quantification in Validation of Analytical MethodLu Jing 1,Fu Lingyan 2,Wang Xu 3(1.National Institutes for Food and Drug Control ,Beijing 100050;2.Jilin C

3、ity Institute for Drug Control ofJilin Province ,Jilin 132001;3.Pharmacopoeia Commission of the People s Republic of China ,Beijing 100061Abstract :The concepts and detecting methods for Limit of Detection and Limit of Quantification were discussed based on the analysis and comparison with IUPAC ,IC

4、H and the other related fields domestic.Several different detection methods were compared by the test experiments.The suggestions were put forward for the provision of the detecting methods.Key words :limit of detection ;limit of quantification中国药典2005年版一部收载了“中药质量分析方法验证指导原则”(以下简称“指导原则”,在很大程度上规范了中药分析

5、方法研究工作中方法学验证的内容,为中药质量标准的规范化、标准化研究提供了保证。然而,该指导原则基本上是模拟化学药品分析方法验证指导原则制定的,对中药质量分析的适用性存在一定问题,2010年版中国药典尚未对相关内容进行修订。其中检测限、定量限的测定方法主要采用信噪比法,与权威国际组织以及我国其它行业(如环境分析、地质分析及水质分析的通行方法或标准相比,有较大的差距。1检测限(检出限“指导原则”1对检测限的定义为:“检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量”。并规定了确定检测限常用“直观法”和“信噪比法”。不同文献使用“检测限”或“检出限”表示这一概念,比较认为“检出限”似乎更适合。检出限一般分

6、为仪器检出限和方法检出限。前者是指在特定的仪器条件下,能可靠检出的最小信号所对应的待测物质的最小量(或浓度;后者则是指一个给定的分析方法在特定条件下能以合理的置信水平检测出被测物的最小量(或浓度2-3。1.1检出限的概念国内一些文献和标准中定义的“检测限”基本表述为仪器检出限的概念4-6。1975年,国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC 正式推行使用检出限的概念及相应估算方法。IUPAC 对检出限定义为:“某特定方法在给定的置信度内可从样品中检出待测物质的最小浓度或量”。1998年,IUPAC 发表的分析术语纲要(IUPAC Compendium of Analysis Nomencla-tu

7、re 7中规定:检出限以浓度(或质量表示,是指由特定的分析步骤能够合理地检测出的最小分析信号x L 求得的最低浓度C L (或质量q L ,并规定应通过实验以足够多的测定次数求出,譬如20次。检出限的公式表示为:C L =ks b /mC L 检出限;m 标准曲线在低浓度范围内的斜率;s b 为空白标准偏差;k 置信因子,一般取2或3。ICH (1996年关于分析方法验证的指导原则中国药品标准2012年第13卷第1期34Drug Standards of China 2012,Vol.13No.1中对检出限的规定,除目测法和信噪比法测定方法外,还规定了基于响应值的标准偏差和标准曲线斜率而定义的

8、检出限8:DL =3.3S响应值的偏差;S 标准曲线的斜率。可以通过一系列方法得到,如测定数据的标准偏差,或基于制备的被分析物在检出限范围内的校准曲线(见下述标准曲线估算法。1.2检出限的测量方法按照ICH 关于分析方法验证的指导原则8,取决于使用的是非仪器方法或仪器方法,检出限的测定或估算方法主要有3种3,7:1.2.1目测法主要用于非仪器方法检出限的确定,如薄层色谱法鉴别或限度检查方法中检出限的测定。可采用已知浓度的被测物样品,按测定方法操作,以目测可有效判断的量或浓度作为检出限。例如薄层色谱法检查盐酸巴马汀的检出限测定:取盐酸巴马汀对照品适量,加乙醇制成每1mL 含0.04mg 的溶液,

9、作为对照品储备液。取1mL ,置10mL 量瓶中,加乙醇稀释至刻度,分别点样1 9L (相当于0.004,0.012,0.020,0.028,0.036g ;另取对照品储备液点样1L ,3L (相当于0.04,0.12g ,展开、目测法检视,最低检出限为0.012g ,见图1。 图1目测法检出限测定1 7为点样量0.004g 0.12g ;8,9为检测样品1.2.2信噪比法适用于能显示基线噪音的仪器分析方法,是通过已知低浓度的被测物的检测信号与基线噪音比较,确定可被检测出的最小量或浓度(一般将信噪比为31或21的量或浓度作为检出限。信噪比法也是一种直观测量的方法,主要用于仪器检出限的测量和判断

10、。1.2.3基于偏差和斜率的方法方法检出限是表征分析方法的最主要的参数之一。分析方法的检出限不仅与仪器噪音有关,还取决于整个分析过程的误差总和,与样品性质、基质及预处理过程等都有关系。基于偏差的测定方法可采用已知标准物质与空白样品,或已知含量的样品在低浓度范围按照分析步骤进行测量,通过分析相当数量的样品(文献报道12 20份计算方法的检出限,计算公式为:C L =k i s i c珔XC L 方法的检出限;k i 置信因子,一般取2或3;s i 样品测量读数的偏差;c 样品含量值;珚X样品测量读数平均值。前述的ICH 的测定方法是基于偏差和校准曲线斜率的测定方法。1.2.4校正曲线估算法9-1

11、0上述基于偏差计算检出限的方法是假定在不同浓度加标测量的标准偏差(或s o ,s i 是一个定值,理论上是不严密的。为此,IUPAC 和欧盟推荐使用标准校正曲线法估算检出限。当浓度或量接近于0,目标分析物的响应很小,测量十分困难,IUPAC 认为可用标准曲线的截距来估算检出限,见图2。图2校正曲线估算法图示如上图,VBx 表示在横坐标上任意浓度点Xi (包括零浓度的不确定度。横坐标上任何一个浓度点的置信区间为:Xi VBx当浓度为0,截距a 的不确定度为VB Y ,a 的置信上限为Yc ,零浓度(空白X 0的置信区间Xc =VBx ,(X =0,即空白上限;Y N 是与检出限X N 相对应的信

12、号值,Y N =a +2VB Y ,检出限:X N =(Y N a bDrug Standards of China2012,Vol.13No.1中国药品标准2012年第13卷第1期35a校准曲线的截距;b校准曲线的斜率实际测定可采用信噪比法粗略估算得到检出限和定量限浓度;在估算的检出限和定量限浓度范围,制备校准曲线,利用上述公式,根据特定校准曲线的截距a,斜率b,剩余标准差S Y及随机统计变量计算出空白上限Xc,检出限X N,测定下限X B(定量限,以此反映在给定条件下分析方法达到的灵敏度水平与数据质量。因上述计算比较繁琐,已有用于检出限计算的软件,如MDL Estimator,可免费下载使

13、用。例如红花药材掺伪染色样品中4种水溶性色素检出限的测定:色谱柱为Agilent TC-C18柱;流动相为乙腈-20mmolL1醋酸铵,0 15min,乙腈5%15%;15 25min,乙腈15%45%。测定溶液的制备:分别取柠檬黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红试剂,分别制成每1mL含0.1mg的混合溶液;分别取红花药材提取液(红花0.5g,加75%乙醇10mL,超声提取15min2mL,精密加上述对照试剂混合溶液0.25,0.5,0.75,1.0,1.25mL,加70%乙醇稀释至5mL。测定法:分别取各浓度的溶液,各进样5L,平行进样5次,测定峰面积值。数据处理:采用MDLEstimator软件处

14、理,直接得到检出限值(MDL;利用斜率、截距值,分别采用ICH计算公式、偏差计算公式计算,分别得到检出限值,并进行比较。3种方法得到的检出限(gmL1比较见表1。表13种检出限测定或估算方法的结果比较成分DL=3.3SC L=k i s ic珚X校准曲线估算法(MDL Estimator柠檬黄0.01930.01840.0255苋菜红0.00740.00730.0127胭脂红0.00740.00870.0184赤藓红0.00150.00150.0035从结果可以看出,ICH法与偏差测定法的结果基本一致;较校准曲线估算法约低一倍。有文献2认为检出限相差两倍以内应认为是无显著性差异。ICH 法的计

15、算相对简单的多,可以作为推荐方法使用。2定量限“检出限”界定待测物质的“有无”,而定量限(也称测定下限界定定性、定量的区间,是指分析方法能够准确测定的浓度或量。指导原则定义的定量限为:“供试品中被测成分能被定量测定的最低量,其测定结果应具一定准确度和精密度。用于限量检查的定量测定的分析方法应确定定量限。常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为101时相应浓度或注入仪器的量进行确定”。与检出限的测定方法类似,ICH关于定量限的测定方法也包括目测法、信噪比法和基于偏差和斜率的方法。其中,信噪比法内容与中国药典规定的内容相同。但在实际试验测定中,是取相当于信噪比10:1的被测物浓度的溶液,重复进样不少

16、于6次,计算响应值的相对标准偏差。根据具体测定方法的精密度要求,如薄层扫描法RSD%3%,或高效液相色谱/气相色谱法2%,该浓度或量即为定量限。基于偏差和斜率方法的计算公式为:QL=10S响应值的标准偏差;S标准曲线的斜率。通过特定校准曲线估算定量限(测定下限的方法已如上述。在检验工作中,当样品测定值低于测定下限,高于检出限时,按“定量限”出具报告,并给出定量限的量值。在痕量分析检测工作中,对低于定量限的样品,可考虑选择其它灵敏度更高的检测方法测定。3讨论“检出”是定性概念,“检出限”是测量计算得出的特定的量值。检出限除表征仪器或方法的灵明度外,在检测结果的判断方面也十分重要。在检验检测工作中,低于分析方法检出限的测量值,按“未检出”出具结论,并需要报告检出限的量值。特别是在痕量分析中,如残留物检测。报告的检出限,应该是方法的检出限,而不是简单的由仪器信噪比判断的数值。因此,明确、规范检出限和定量限的测量方法十分必要。参考文献1中国药典S2010年版一部2010附录130-1312田强兵分析化学中检出限和测定下限的探讨J化学分析计量,2007,16(3:72-733冉敬,杜谷,杨乐山,等关于检出限的定义及分类的探讨J岩矿测试,2008(4,27(2:155-1574GB/T13966-1992分析仪器术语S5GB/T4470