血清HIV抗体阴性静脉药瘾者肝组织HIV DNA测定

1、血清HIV抗体阴性静脉药瘾者肝组织HIV DNA测定吴南屏刘克洲陈智李继承R.H.Dennin 【摘要】目的了解血清抗-HIV阴性的静脉药瘾者肝组织是否存在前病毒HIV DNA。方法 选择38例抗-HIV阴性的静脉药瘾者肝组织，10例非静脉药瘾者肝组织，用巢式聚合酶链反应，分别在HIV gag、pol、env三大结构区，用六对引物进行HIV DNA扩增。结果38例中有3例同时在三个区域测到HIV DNA，12例分别在二个区域、17例在单一区域检测到HIV DNA，6例在HIV三个区域均阴性。对照组10例无一例检到HIV DNA。结论抗-HIV阴性的静脉药瘾高危人群，存在潜在HIV感染。提示潜在

2、HIV感染的检测及加强窗口期HIV的监测十分重要。 【关键词】静脉药瘾抗-HIV人类免疫缺陷病毒DNA Detection of HIV DNA by nPCR in liver tissue of anti-HIV seronegative intravenous drug usersWu Nanping,Liu Kezhou,Chen Zhi,et al.Institute of Infectious Diseases,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310003 【Abstract】ObjectiveThe study was designed

3、to investigate whether there existed provirus HIV DNA in the liver tissues of intravenous drug users (IVDU) with seronegative results of anti-HIV test.MethodsWe detected 38 liver tissues of seronegative IVDUS and 10 liver tissues of non-IVDUS.Using different primers in HIV gag,env as well as pol reg

4、ions respectively,HIV DNA was detected by nPCR.ResultsIn all 38 cases,3 simultaneously reacted to all three HIV regions (HIV,gag,env,pol),12 reacted to two HIV regions,17 reacted to single HIV region and 6 cases did not react to any HIV region.No sample of control group was found reacting to any HIV

5、 region.ConclusionIt showed that there might exist HIV infection is some of HIV seronegative IVDUS at high risk of HIV infection.So it is very important to detect potential infection and prevent windows HIV infection. 【Key words】Intravenous drug usersAnti-HIVHIV DNA 从HIV感染到机体产生抗-HIV，其窗口期时间长短直接与HIV感染

6、的量、毒力、感染方式及人体遗传、免疫状况有关。国外报道已在血清HIV抗体阴性的静脉药瘾者中找到特异的HIV DNA，其阳性率高达23%80%16，但作者尚未见组织中找到HIV DNA的报道。我们对38例抗-HIV阴性静脉药瘾者肝组织，用六对引物分别在HIV LTR-gag、pol、env区进行HIV核酸扩增，以了解高危人群HIV抗体阴性者HIV感染情况及探讨可能的HIV免疫逃逸机制。 材料与方法 一、标本来源 38例标本均来自德国，为血清抗-HIV阴性的静脉用药过量死亡者的肝组织。无菌条件下取肝组织，迅速深低温-70保存备用。死亡前作为HIV高危人群，ELISA(德国Mercke公司)测定为抗

7、-HIV阴性。10例对照组标本系抗-HIV阴性的因交通事故经外科手术切除的部分肝组织标本。 二、肝组织DNA抽提 取400mg新鲜冻存肝组织，低温下磨碎(匀浆器事先用三蒸水处理18030分钟干烤消毒，并一次使用后丢弃)加500l预冷的2lysis(Tris-HCl 0.02mmol/L,NaCl0.3mmol/LEDTA0.02mol/L, 2% SDS pH7.8)及终浓度为500g/ml的蛋白酶K。混匀55保温3小时，9510分钟灭活蛋白酶K。加等量酚：氯仿(11)3 500r/min离心15分钟，重复2次后，用等量氯仿，3 500r/min离心15分钟。取上清用2倍量的100%乙醇和1/

8、10体积的3mol/L醋酸钠沉淀DNA，-20过夜，次日13 000r/min离心15分钟，沉淀用70%乙醇洗涤，室温干燥，用80l TE(Tris-HCl0.01mol/L EDTA 0.001mol/L)溶解DNA，4备用。为防止交叉污染，所有工作均在不同的无菌超净台进行，抽提过程均使用一次性无菌器皿。 三、寡核苷酸引物的选择 HIV特异的引物按已发表的序列由德国吕贝克大学微生物研究所合成，六对引物分别位于HIV LTR-gag、pol、env区，所有标本均用套式PCR对HIV不同区域逐一扩增。HIV LTR-gag外套引物为M667/SKO3C(449-956)，内套引物为M661/SK

9、O1C(675-920)，HIV pol外套引物pol 104/pol 4(2394-3117)，内套引物pol 3/pol 312k(2810-3017)，HIV env外套引物env 526/env co2(7800-7989)，内套引物env col/571k(7855-7942)其扩增片段分别为HIV LTR-gag 245bp,pol 208bp,env 88bp。 四、聚合酶链反应(PCR) PCR条件HIV LTR-gag,pol,env不同引物及标本分别在灭菌的Eppendorf管中进行，各管反应总体积为100l，内含10l 10PCR buffer(MgCl2 0.025mo

10、l/L、KCl 0.05mol/L,Tris-HCl 0.01mol/L pH9.2)8l dNTP每种200Umol/L,1l 1%凝胶，引物20pmol、模板DNA 10l DNA聚合酶3U。所有试剂及酶均由德国Mercke公司提供,加DH2O总量至100l。PCR扩增程序为95 1.5分钟后，94 1.5分钟，56 1.5分钟，72 1.5分钟共35个循环，72延伸5分钟。扩增内套用相同程序，所不同的是取5l第一次扩增产物作二次扩增。模板二次扩增产物在2%的琼脂糖凝胶电泳(0.5g/ml EB)观察结果。 表1肝组织HIV DNA测定总结果 组别 套式PCR* 各组别HIV特异区域nPC

11、R扩增结果 +(%)-(%) LTR-gag env pol +(%) -(%) +(%) -(%) +(%) -(%) 实验组 32 6 30 8 10 28 10 28 (84.2) (15.8) (78.9) (21.1) (26.3) (73.7) 26.3 (73.7) 对照组 0 10 0 10 0 10 0 10 (100) (0) (100) (0) (100) (0) (100) * HIV各区域只要有一个区域nPCR为阳性，即作为阳性结果统计；HIV各区域均阴性作为阴性结果统计 结果 一、肝组织HIV DNA测定结果 见表1，使用不同区域HIV的六对引物，用套式PCR分别检

12、测HIV DNA特异基因。从表1我们可以看到38例肝组织中有30个在HIV LTR-gag区对引物M667/sk03c M661/sk01c发生特异扩增。10个标本(26.3%)对HIV env区引物env 526/CO2、env COl/571k发生特异性扩增。10例标本(26.3%)对HIV-pol引物pol 104/pol4、pol3/321k发生特异性扩增。 二、HIV特异区域nPCR分类结果 见表2。可发现38例中有3个同时在HIV LTR-gag、pol、env三个区域产生特异性条带，12例分别对HIV LTR-gag和pol区或HIV LTR-gag、env区产生特异性条带，17

13、个单一LTR-gag或pol、env产生特异性条带。6例标本在HIVLTR-gag、pol、env均不产生特异性条带。对照组10例在HIV各个区域均未发现阳性结果。 表2各HIV特异区域nPCR分类结果 标本编号 nPCR结果 标本编号 nPCR结果 LTR-gag env pol LTR-gag env pol 1 + + + 20 - - - 2 + - + 21 + - - 3 + - + 22 + - - 4 - - + 23 + - - 5 + - + 24 - - - 6 + - + 25 + + - 7 + - - 26 + - - 8 + + + 27 - - - 9 + +

14、- 28 + - - 10 + - - 29 + + - 11 + + - 30 + - - 12 + - - 31 + + - 13 + + + 32 + - + 14 - - - 33 - - - 15 - - - 34 + - - 16 - - + 35 + - - 17 + - - 36 + - - 18 + + - 37 + - - 19 + + - 38 + - - 讨论 研究HIV静止窗口感染期是非常重要的。此期如感染了HIV而未被检出，感染者可作为潜在传染源在机体免疫功能低下时，病毒扩增而引起HIV的传播。本试验从38例静脉药瘾过量死亡者肝组织中抽提DNA，用套式PCR及6对特

15、异HIV引物分别在HIV LTR-gag、pol、env扩增HIV DNA。结果发现32/38例(84.2%)静脉药瘾者肝组织标本中可测到特异的HIV DNA，其中3例标本在HIV LTR-gag、pol、env同时测到HIV DNA特异序列，12例标本同时在2个区域HIV LTR-gag、pol或HIV LTR-gag、env区测到HIV DNA，17个单一区域测到HIV DNA。6例标本在HIV LTR-gag、pol、env三个区域全部阴性。已知HIV血清转换期可达1842个月4，个别可达63个月7，此期HIV感染，病毒可持续潜伏或宿主产生免疫耐受。因此用PCR检测低水平HIV前病毒DN

16、A感染十分必要。有关静脉药瘾者感染HIV，但血清抗体阴性，国外报道可能与下列因素有关。HIV感染到抗体阳转，一般在6周左右，但国外报道静脉药瘾者其窗口期可达6个月以上6，8，这可能是HIV感染量少、病毒潜伏或整合在一些敏感细胞内如外周的单个核细胞内，暂时不被激活，而逃逸了机体免疫监视。也可能是静脉药瘾者年轻，机体免疫功能好而抑制了病毒表达。其次，静脉药瘾者可能有不同平常的血清转化期，其它HIV病毒亚型的感染或同时感染其他病毒，使其持续处于窗口静止期。Farzadegan等9报道同性恋者可以有一些高选择HIV亚型感染，以致使其HIV抗体持续阴性，而造成传播。选择肝组织作研究是因为肝内大量存在枯否

17、细胞，它是一类单核细胞系，是HIV感染的敏感细胞，加之肝血流量大，极易感染；其二，抗-HIV阴性而淋巴细胞内已感染HIV已有报道69，而组织整合HIV未见报道；其三，肝组织来源丰富易保存。本试验着重做整合HIV RNA，故选择肝组织。关于PCR污染问题，Sabion等10报道可存在0.5%1%操作污染，在我们的研究中已事先考虑了这个问题，在整个操作过程中除均使用一次性器皿外均设对照组，并且在不同实验室重复实验，结果令人满意。对照组为非静脉药瘾者无一例阳性。 用套式PCR证实存在HIV DNA特异序列，说明静脉药瘾血清HIV抗体阴性并不意味没有受HIV感染，相当一部分人已感染了HIV并可作为潜在

18、传染源而威胁他人。关于静脉药瘾者血清抗体阴性持续时间的长短，它们之间HIV RNA和HIV DNA之间的关系及是否感染HIV亚型或合并其他病毒感染将作进一步研究报道。 本课题受国家自然科学基金资助(39780036) 作者单位：310003杭州，浙江医科大学传染病研究所(吴 南屏、刘克洲、陈智、李继承)；德国吕贝克医科大学(R.H.Dennin) 参考文献 1Schnittman SM,Greenhouse JJ,Psallidopoulos MC,et al.Increasing viral burden in CD4+T cells from patients with HIV infec

19、tion reflects rapidly progressive immunosuppression and clinical disease.Ann Intern Med,1990,113:438-443. 2Imagawa DT,Lee MH,Wolinksy SM,et al.Human immunodificiency virus type-1 infection in homosexual men who remain seronegative for prolonged period.N EngL Med,1989,320:1458-1462. 3Sorlano V,Hewlet

20、t I,Tor J,et al.Silent HIV infection in heterosexual partners of seropositive drug abusers in spain.Lancet,1990,335:860-864. 4Hewlett LK,Gregg RA,Ou CY,et al.Detection in plasma of HIV-1 specific DNA and RNA by polymerase chain reaction before and after seroconversion.J Clin Immunoassay,1988,11:161-

21、164. 5Beretta A,Stanley H,Weiss F,et al.Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-seronegative injection drug users at risk for HIV exposure have antibodies to HLA class I antigens and T cells specific for HIV envelope.J Infect Dis,1996,173:472-476. 6Markham D,Yiaofang Yu,Farzadegen H,et al.Immunodeficiency virus type 1 env and p17gag seronegative injection drug users.J Infec Dis,1995,171:797-804. 7Nelson