海藻油DHA-国家食品安全风险评价中心

1、、添加剂的通用名称、功能分类、用量和使用范围2.1名称通用名：bbgiv伊半乳糖告酶英文名：bbgiv 伊galactosidaseiubmb化学名：,半乳糖甘酶iubmb编号ec 3.2.1.23cas号9031-11-2einecs 号:232-864-1同义词：乳糖酶来源：两岐双岐杆菌 (bifidobacterium bifidum )2.2功能分类、用量和使用范围4申报功能为酶制剂，用于生产低聚半乳糖。3半乳糖甘酶是食品添加剂 gb2760-2011中规定允许用的酶制剂，其来源的微生物包 括胞壁克鲁维酵母，黑曲酶，米曲霉，鲁克茹维酵母等。2014年6月24日卫生计生委公开征求意见的“

2、低聚半乳糖国家标准”（国卫食品函【2014 527号），范围中规定：“本标准适用于以乳糖为原料，经环状芽抱杆菌及 gb 2760批准使用的 菌种生产的b -半乳糖普酶催化水解半乳糖昔键，将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，同时通过 转移半乳糖昔的作用，将水解下来的半乳糖甘转移到乳糖分子，生成的食品营养强化剂低聚 半乳糖。”克拉萨多配料有限公司（克拉萨多）出品的低聚半乳糖生产过程中使用的酶制剂bbglv伊半乳糖甘酶来源于两岐双岐杆菌ncimb 41171 （两岐双岐杆菌 b. bifidum strain, ncimb41171,来源于人类健康志愿者（tzortzis et al., 2005）。两岐

3、双岐杆菌不在 gb2760-2011规定 的伊半乳糖甘酶来源的微生物名单中，也不在正在征求意见的食品营养强化剂低聚半乳糖国 标中规定的3 -半乳糖甘酶来源的微生物名单中，因此本公司特申请两歧双岐杆菌来源的3-半乳糖普酶作为酶制剂，主要用来生产低聚半乳糖。两岐双岐杆菌常用作益生菌，两岐双岐杆菌在食品工业中早已广泛应用，efsa将其列在ops名单中，也在卫生部发布的可用于食品的菌种名单（卫办监督发201065号）中,已在食品和保健食品中广泛应用，是安全性极高的菌种。同样的，用两岐双岐杆菌生产的b半乳糖甘酶是非常安全的，不用担心其毒性、过敏性和其他不良效应。2.3使用量和使用范围按1g good m

4、anufacturing practice （cgmp） 原则，bbglv 伊半乳糖甘酶使用原则是依照达到最大效果的最小使用量来使用。克拉萨多公司经过反复研究确认，生产低聚半乳糖所需要的酶的典型使用量是：每公斤乳糖需要0.1到0.22 g酶。生产bimuno ?必米诺 （低聚半乳糖）糖号b bbgiv伊半乳糖甘酶的典型添加量是0.013%（w/w）。克拉萨多公司申请的bbgiv伊半乳糖甘酶仅用于生产本公司的产品bimuno ?必米诺（低聚半乳糖），且本公司生产的bimuno ?必米诺（低聚半乳糖）已在欧盟、美国、澳大利亚和新西兰、韩国等国家广泛应用，被批准用在婴幼儿食品及各类食品和膳食补充剂中

5、为半乳糖甘酶第三部分：证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件三、证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件低聚半乳糖对肠内的益生菌群有很强的增殖作用，被双岐杆菌等益生菌利用，刺激肠道双岐杆菌的生长，减少有害微生物的生长和有害发酵产物的生成，同时具有和植物膳食纤维相同效用，可促进肠胃蠕动，改善肠道功能。因此我国已批准低聚半乳糖允许用在婴幼儿食品中，新资源食品也已批准低聚半乳糖作为食品原料广泛用在食品中。欧盟、美国、日本、韩国、澳大利亚新西兰等许多国家也已批准低聚半乳糖作为益生元物质在婴幼儿食品及各类 食品中广泛使用。低聚半乳糖是以牛乳中的乳糖为原料，经b-半乳糖普酶催化水解半乳糖昔键，生成

6、半乳糖和葡萄糖，并通过转半乳糖昔的作用，将水解下来的半乳糖 甘转移到乳糖分子，生成低聚半乳 糖。而其中，影响低聚半乳糖功效性的决定性因素，就是工艺中用于催化水解的酶制剂：3-半乳糖甘酶的来源的不同，相应的低聚半乳糖的功效也不同。不同菌种来源生产的b -半乳糖普酶作为酶制剂生产得到的低聚半乳糖产品，其功效性也有很大的不同。3半乳糖甘酶是食品添加剂 gb2760-2011中批准的可以使用的酶制剂，主要来源包括 胞壁克鲁维酵母，黑曲酶，米曲霉，鲁克茹维酵母等。而新资源批准的低聚半乳糖中所使用 的伊半乳糖甘酶来源为环状芽抱杆菌，不在gb2760-2011批准之列。克拉萨多配料有限公司(克拉萨多)出品的

7、低聚半乳糖生产过程中使用的酶制剂bbglv3半乳糖甘酶来源于两岐双岐杆菌ncimb 41171 (两岐双岐杆菌 b. bifidum strain, ncimb41171,来源于人类健康志愿者(tzortzis et al., 2005),属于双歧杆菌菌属。3.1 功能类别及作用机理以益生菌为来源生产b -半乳糖甘酶的基本原理是：酶的起源，对终产品低聚半乳糖的组分以及功效都非常重要。来源于益生菌的3 -半乳糖甘酶从乳糖中催化合成的低聚半乳糖产品，更容易被b -半乳糖甘酶所来源的益生菌进行代谢，达到益生菌对益生元物质更高的选择性(rabiu et al., 2001)。双歧杆菌是肠道益生菌，有维

8、护肠道正常细菌菌群平衡、抑制病原菌的生长，防止便秘，腹泻和胃肠障碍等功效；此外还可改善乳制品的耐乳糖性，提高消化率，增强人体免疫机能。因此以两歧双岐杆菌为来源的b -半乳糖甘酶作为酶催化水解从乳糖中制取的低聚半乳糖产品，例如克拉萨多公司的 bimuno ?必米诺产品，跟其他低聚半乳糖产品相比，其功效上有更多优势，尤其对双歧杆菌菌属有更局的选择性lactosegalacto-oligosaccharide图1 ：伊半乳糖甘酶催化的低聚半乳糖的合成3.1.1 两岐双岐杆菌来源的伊半乳糖甘酶的活性对两岐双岐杆菌来源的 bbglv伊半乳糖甘酶的活性进行了研究。bbglv伊半乳糖甘酶的活 性定义如下：一

9、个单位酶活性定义为每分钟( ph 6.8和40oc)催化生成1微摩尔邻硝基苯 的生成率，用 对硝基苯基-伊d-叱喃半乳糖昔制备标准校正曲线。goulas et al. (2009)。对理想的ph和温度进行研究，见图 2和 图3,表示热和ph稳定性, 在55 c以上时活性失活。图2:在ph (1)和 温度下(2),理想的b-半乳糖甘酶活性(1) ph活性020406080temperature pc)(2)温度活性(ph 6.5)图3: bbglv伊半乳糖甘酶活性ph (1)和热稳定性(2)temperature (x)phph稳定性(55 c, 1小时处理) 热稳定性(ph 6.5, 1小时处

10、理)3.1.2 底物特异性goulas et al. (2009)对来源于两岐双岐杆菌 ncimb 41171 的小半乳糖酶底物特异性进行了研究，研究结果见表 1表1:来源于两岐双岐杆菌 ncimb 41171的b-半乳糖酶底物特异性底物%相对活性u/mg乳糖1001903-d-(1 6)半乳二糖4.7 0.99.03-d-(1 t)半乳二糖-伊d-(1 t)半乳糖基乳糖-n-乙酰乳糖胺61.1 42116.0lacto-n-biose i-乳果糖3.5 0.56.6岩藻五糖-土标准偏差，n=3 ,(-)表小未检出。底物为乳糖的b -半乳糖酶活性最强。3.1.3 储存稳定性伊半乳糖酶储存在(-

11、18 c),仍在起始酶活性的10 %范围之内，研究结果保存期在12个月之内months(更 awwe e+jeajh3.2 以两歧双歧杆菌为来源的3 -半乳糖甘酶生产的低聚半乳糖（bimuno ）和其他来源的3 -半 乳糖甘酶生产的低聚半乳糖（vivinol gos ）的效果比较克拉萨多公司从两岐双岐杆菌 ncimb 41171中制取b-半乳糖甘酶，主要是用于生产克拉 萨多公司的低聚半乳糖产品 bimuno ?必米诺。必米诺是以乳糖为原料，通过b -半乳糖甘酶对 乳糖中的低聚糖作用转化而得到的半乳糖混合物。通常，乳糖碳链通过这种方法主要转化为 双糖、三糖、四糖及五糖物质。3.2.1 酶来源vi

12、vinal gos （同类产品）和 bimuno （必米诺,克拉萨多产品）都是天然的 gos （低 聚半乳糖）食品补充剂，都是利用天然存在的半乳糖甘酶从乳糖中生产所得。这些酶都是由非致病性微生物（表1）而来，经过特定的条件刺激，催化乳糖依照通用流程（ e:酶；lac: 乳糖；glu:葡萄糖；gal:半乳糖；nu :核受体） 转化为gos （低聚半乳糖）。gal + ee+lacglue - galgal -nu + e表1: vivinal和biminuo生产过程中所使用的酶vivinal gosbi2muno ?enzymes 酶 micro-organismbiohazard level

13、taxonomy gram stain human health微生物生物危害级别分类学革兰氏染液人类健康b-galactosidase 伊半乳糖甘酶 bacillus circulans 环状芽抱杆菌1 bacterium 细菌 positive 阳性although not a major pathogen, b. circulans has been reported to cause infections虽然不是主要的病原体，环 状芽抱杆菌曾被报告引起 感染b-galactosidase 伊半乳糖甘酶 bifidobacterium bifidum 两歧双歧杆菌1 bacterium

14、细菌 positive阳性lactic acid bacterium gras, extensive use as probiotic乳酸菌gras 作为益生菌了泛使用*用于生产bimuno ?必米诺的酶是两歧双歧杆菌细胞的固定化酶3.2.2 生产vivinal gos的生产，是乳清乳糖在批式反应器中经过酶孵化后精炼而来，然后对孵化液进 行脱色，蒸发处理得到糖浆，或者喷雾干燥得到粉末，然后包装bimuno ?必米诺的生产，是乳清乳糖在批式反应器中经过固化酶（两歧双歧杆菌细胞）孵化 后精炼而来，然后通过离心分离出去固化酶，溶液经过纳米过滤，蒸发得到糖浆，包装；或 者通过喷雾干燥制成粉末，包装。3

15、.2.3 gos （彳氐聚半孚l糖）组分两个产品都是由不同长度的低聚半乳糖链组成的。（表2）表2:两种产品的碳链和gos含量百分比vivinal gosbi2munomonosaccharides单糖2323disaccharides (of which lactose)二糖(其中乳糖)32 (20)32 (15)gos (dp=3)4545两种产品糖浆理化指标和微生物属性vivinal gosbi2munodry matter (w/w)干物质75%75%galacto-oligosaccharides低聚半乳糖含量60% on dm62% on dmlactose 乳糖20% on dm1

16、5% on dmglucose葡萄糖19% on dm22% on dmgalactose半乳糖1% on dm1% on dmprotein蛋白质0.03% on dm0.03% on dmash灰分0.15% on dm0.04% on dm微生物c.f.u.母克粉 微生物，每克粉中total viable counts总活菌数 300080enterobacteriaceae肠杆菌科absent in 1 g未检出 10salmonella沙门氏菌absent in 25g不得检出absent in 25g不得检出yeast酵母 50 10moulds霉菌 5012,000分析程序g96

17、0p, bbgivgalactosidase assayph （1%水溶液）6.5 to 7.5ph计铅（以 pb 计）/（mg/kg）3gb 5009.12 法总碑(以 as 计)/(mg/kg)1gb/t5009.11 法2.1.3微生物指标：应符合表 3的规定。表3微生物指标项目指标检验方法菌落总数(cfu/g)50,000gb 4789.2大肠菌群(cfu/g)1200015184 u/g外观白到棕色棕色菌落大肠在水溶液外观清澈清澈微生物指标总数（cfu/g）50,00010翦群（cfu/g）&1010沙门氏菌(25 g)不得检出没有检出大肠杆菌(25 g)不得检出没有检出污染指标铅（

18、mg/kg ）31.54碑（mg/kg ）11200015153 u/g外观白到棕色棕色在水溶液外观清澈清澈微生物指标总数（cfu/g）50,00010翦群（cfu/g）1010沙门氏菌(25 g)不得检出没有检出大肠杆菌(25 g)不得检出没有检出污染指标铅（mg/kg ）30.779碑（mg/kg ）11200015172 u/g外观白到棕色棕色在水溶液外观清澈清澈微生物指标总数（cfu/g）50,00010翦群（cfu/g）&1010沙门氏菌（25 g）不得检出没有检出大肠杆菌（25 g）不得检出没有检出污染指标铅（mg/kg ）31.63碑（mg/kg ）11打热冷却i包装4.2.2使用b-半乳糖甘酶生产低聚半乳糖的主要步骤生产过程条件开始乳糖浓度42%热处理步骤80 c/10 mins (equiv bulk)伊半乳糖甘酶使用量(w/w)0.013%合成温度（c）54合成时间（h） 24ph