实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳课件

1、实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验九实验九-十十 植物过氧化物酶同工酶植物过氧化物酶同工酶 的测定（凝胶圆盘的测定（凝胶圆盘电泳法）电泳法）生物化学实验之生物化学实验之实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳【实验目的】【实验目的】 1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理；理； 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术；泳的操作技术； 3. 学习过氧化物酶同工酶的检学习过氧化物酶同工酶的检测方法。测方法。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳【实验原理】【实验原理】 以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为以聚丙烯酰胺为支

2、持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。）。 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在）在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。度加以调节。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶结结构构实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳 PAGE电泳兼有电荷效应和分子筛效电泳兼有电荷效应和分子筛效应。由于被分离物质所载电荷数量、分子应。由

3、于被分离物质所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的永动速率而相互分离。利用特异性的同的永动速率而相互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可以在凝颜色反应使待测酶着色，这样就可以在凝胶中展现出酶谱。胶中展现出酶谱。 实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳 为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率,通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离胶中的离子成分、胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不

4、同，电泳、凝胶浓度不同，电泳开始后，由于浓缩效应开始后，由于浓缩效应,较厚的样品层可以被较厚的样品层可以被浓缩的很薄，使电泳具有良好的分辨率。浓缩的很薄，使电泳具有良好的分辨率。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳 过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。它能催化它能催化H2O2将联苯氨氧化成蓝色或棕褐将联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物。因此，将经过电泳后的凝胶置于色产物。因此，将经过电泳后的凝胶置于H2O2-联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多

5、条有色带即构成过氧化物酶同工的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶的酶谱。酶的酶谱。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳【器材与试剂】【器材与试剂】（一）材料（一）材料 小麦芽小麦芽（二）仪器设备（二）仪器设备 稳流稳压电泳仪、冷冻离心机及离心管、稳流稳压电泳仪、冷冻离心机及离心管、 成套电泳槽（圆盘型），成套电泳槽（圆盘型），pH试纸，其他常规用具试纸，其他常规用具 （三）（三） 试剂试剂 1、分离胶缓冲液（、分离胶缓冲液（pH 8.9） 2、分离胶贮液、分离胶贮液 3、过硫酸铵溶液、过硫酸铵溶液 4、浓缩胶缓冲液、浓缩胶缓冲液 5、浓缩胶贮备液、浓缩胶贮备液 6、电极缓冲液、

6、电极缓冲液 7、四甲基乙二胺（、四甲基乙二胺（TEMED） 8、0.1%溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液 9、联苯胺染色母液、联苯胺染色母液 实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳【实验步骤】【实验步骤】 （一）过氧化物酶的提取：取（一）过氧化物酶的提取：取812粒发芽粒发芽的麦粒，加入的麦粒，加入1ml H2O 或或0.5mol/L Tris- HCl缓冲液（缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。），冰浴上研成匀浆。 转入离心管，再用转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵上述溶液冲洗研钵壁并全部转入离心管，壁并全部转入离心管，4000r/min离心离心10 min，上清液供电泳分析用。，上清

7、液供电泳分析用。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳 （二）凝胶的制备（二）凝胶的制备 1.准备工作：准备工作： （1）将一空心橡皮塞套在）将一空心橡皮塞套在距玻璃管上端距玻璃管上端2cm处。处。（2）用封口膜封住玻璃管）用封口膜封住玻璃管下端至不漏液体。下端至不漏液体。 实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳3.制备小孔胶（分离胶）制备小孔胶（分离胶） 取取2个小烧杯，按个小烧杯，按A:C:水水:F等于等于1:2:1:3的比例，分别取的比例，分别取A液、液、C液和水置液和水置于一小烧杯中，混匀；于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯液置另一小烧杯中。将两个小烧杯同时放在真

8、空干燥器中。将两个小烧杯同时放在真空干燥器中同时抽气中同时抽气510min，可见有气泡冒出。，可见有气泡冒出。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳 将将2个小烧杯内的液体倒在一起轻轻混匀个小烧杯内的液体倒在一起轻轻混匀（勿重新带入空气），用滴管先取少量凝胶液加（勿重新带入空气），用滴管先取少量凝胶液加至玻璃管内并甩几下，使液体置于底部，同时注至玻璃管内并甩几下，使液体置于底部，同时注意观察是否漏胶。然后尽快将其它凝胶液装入至意观察是否漏胶。然后尽快将其它凝胶液装入至达高度距上端口达高度距上端口1cm为止。仔细地向表面加一层为止。仔细地向表面加一层水以隔绝空气。此时可水以隔绝空气。此

9、时可 见水与胶之间有一界线，见水与胶之间有一界线，但很快消失。但很快消失。 将玻璃管垂直固定在一试管中，将玻璃管垂直固定在一试管中， 置置2535温箱聚合温箱聚合3060min，当再次看到水与凝胶之间，当再次看到水与凝胶之间的界线时，表示聚合完成。吸去表面的水。的界线时，表示聚合完成。吸去表面的水。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳4.制备大孔胶（浓缩胶）制备大孔胶（浓缩胶） 取取2个小烧杯，按照个小烧杯，按照B:D:E:F等于等于1:1.5:1:4的比例，分别取的比例，分别取B液、液、D液和液和E液置液置于一小烧杯中，混匀；于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中，液置另一小烧杯

10、中，抽气。将抽气。将2个小烧杯内的液体轻轻混匀加至小个小烧杯内的液体轻轻混匀加至小孔胶上面孔胶上面1cm高度，仔细地向表面加一层水。高度，仔细地向表面加一层水。2535聚合聚合2030min，聚合后的大孔胶，聚合后的大孔胶呈乳白色。仔细吸去表面的水。呈乳白色。仔细吸去表面的水。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳（三）电泳（三）电泳1.安装电泳槽：安装电泳槽：向电泳槽下槽加入向电泳槽下槽加入适量甘氨酸适量甘氨酸Tris电电泳缓冲液。去掉玻泳缓冲液。去掉玻璃管下端的封口膜，璃管下端的封口膜，将玻璃管固定在电将玻璃管固定在电泳槽上，阴极在上，泳槽上，阴极在上，阳极在下。阳极在下。实验9

11、10植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳2.点样：点样：取样品取样品50L，蔗糖，蔗糖溴酚篮溴酚篮50L, 混匀，混匀，加入玻璃管中。加缓加入玻璃管中。加缓冲液至浸没过玻璃管冲液至浸没过玻璃管上端口及电泳槽上盖上端口及电泳槽上盖的电极。排除玻璃管的电极。排除玻璃管下端口的气泡，连接下端口的气泡，连接好电泳仪。好电泳仪。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳3. 电泳：开始电流为电泳：开始电流为23mA/管，当样品至分离管，当样品至分离胶时，电流加大到胶时，电流加大到45mA/管。当溴酚蓝指示剂接管。当溴酚蓝指示剂接近管底时切断电源，终止电泳。近管底时切断电源，终止电泳。实验910植

12、物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳4. 剥胶：取下玻璃管，用装有长针头的注射剥胶：取下玻璃管，用装有长针头的注射器沿玻璃管内壁慢慢地边注水边进入，并试器沿玻璃管内壁慢慢地边注水边进入，并试着沿玻璃管内壁轻轻转动针头。当胶条松动着沿玻璃管内壁轻轻转动针头。当胶条松动时，用洗耳球小心地将胶条压出，装于试管时，用洗耳球小心地将胶条压出，装于试管中。中。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳（四）染色：（四）染色：临用时配制染色液：（临用时配制染色液：（10 ml ） 联苯胺母液联苯胺母液 0.5 ml H2O 9.3 ml 3% H2O2 0.2 ml 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过

13、将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过胶条）。约胶条）。约10min后用自来水冲洗。后用自来水冲洗。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳（五）记录并计算：（五）记录并计算： 观察、记录酶谱，并观察、记录酶谱，并计算各同工酶的相对计算各同工酶的相对迁移率。迁移率。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳【要点提示】【要点提示】1. 分离胶聚合时间应控制在分离胶聚合时间应控制在3060min，聚合过，聚合过快使凝胶太脆易断裂，主要是快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或或TEMED过过量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或或TEMED用量不足或已失效。用量不足或已失效。2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分离胶后应通过控制电压，调节电流不超过离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/管。管。实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳【思考题