GST pull-down技术验证CIPK7蛋白激酶与CBL1蛋白的相互作用

1、gst pull-down技术验证cipk7蛋白激酶与cbl1蛋白的相互作用文章编号:0455-2059201306-0828-05gst pull-down技术验证cipk7蛋白激酶与cbl1蛋白的相互作用1,2 3 1,2 3黄聪琳 , 丁 硕 , 姜 华 , 安黎哲1.甘肃省中医院,兰州 7300502.甘肃省中医药研究院,兰州 7300503.兰州大学生命科学学院,兰州 730000摘 要: 采用dna重组技术,构建pgex-4t-3-cipk7和pet28-cbl1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化gst标签、his标签融合蛋白,通过gst pull

2、-down试验验证cipk7与cbl1之间的相互作用. 成功构建了cbl1和cipk7的重组质粒,经诱导表达及纯化获得了可溶性gst-cipk7和cbl1-his融合蛋白, gst pull-down试验证实了cbl1能够与cipk7结合. cipk7蛋白与cbl1蛋白之间存在直接的相互作用,为进一步研究蛋白激酶cipk7的功能奠定了基础.关键词: cbl1蛋白; gst pull-down; cipk7蛋白;蛋白质相互作用中图分类号: q71 文献标识码: aidenti?cation of the interaction between cipk7 kinase and cbl1prote

3、in by gst pull-down assay1,2 3 1,2 3huang cong-lin , ding shuo , jiang hua , an li-zhe1. gansu provincial hospital of traditional chinese medicine, lanzhou 730050, china2. gansu provincial academy of chinese medicine, lanzhou 730050, china3. school of life sciences, lanzhou university, lanzhou 73000

4、0, chinaabstract: with the dna recombinant technique, the plasmids pgex-4t-3-cipk7 and pet28-cbl1 wereconstructed. then the plasmids were transformed into e. coli and induced to express the target proteins. gstand his tagged fusion proteins were puri?ed by a?nity chromatography. the binding of cipk7

5、 and cbl1 wasimproved via gst pull-down assay. the expression vectors of cipk7 and cbl1 were successfully constructed,and the soluble gst-cipk7 fusion protein and cbl1-his tagged protein were obtained via expression andpuri?cation. thebindingofthetwoproteinswascon?rmedbygstpull-downassay. thisworkpr

6、ovedthatthereis a direct interaction between cipk7 and cbl1, and provides some promising clue for the further explorationinto the function of cipk7 kinase.key words: cbl1; gst pull-down; cipk7; protein-protein interaction次生代谢产物通常是药用植物的主要活性成 中药次生代谢产物积累的影响引起国内外学者的15物是植物在长期进化过程中与环境相互作用的结 素含量有一定促进作用水分胁迫

7、下,黄芩根中2 6果从自然因素的角度分析,环境生态因子对药 的黄芩苷含量上升不同光质照射下,冬凌草中7用植物的生长压力与药用植物对环境因子的适应 冬凌草甲素和迷迭香酸积累量不同较低的平3?4 8是道地药材形成的生态学机制环境胁迫对 均温度有利于黄酮类物质的积累研究环境胁收稿日期:2013-02-28; 修回日期:2013-04-09基金项目:国家科技重大专项资金项目2009zx08009-029b;甘肃省科技支撑计划项目2009gs03292作者简介:黄聪琳1983?,女,甘肃兰州人,助理研究员,博士, e-mail: huangcl2028hotmail,研究方向为药用植物分子生物学.第6期

8、 黄聪琳,等:gst pull-down技术验证cipk7蛋白激酶与cbl1蛋白的相互作用 829迫对药用植物活性成分的生物合成途径、信号转 5-ggatccatggaatcacttccccagccg-3,导对阐释药用植物有效成分成因和道地药材形成 下游引物primerr: 5-gcggaattcttacatga机制具有重要意义. tgtcattgtgccatga-3.扩增cbl1基因cds2+全长,上游引物primerf: 5-ttatccgccttttc钙离子ca 介导的信号系统参与众多植物9ttcgttatcc-3,下游引物primerr: 5-ctcgt响应环境胁迫的信号转导 ,对钙信

9、号系统的研ggcaatctactcggtctta-3.究一直是科研工作者关注的热点. 近年来,发现植物特有的一类钙感受器,钙调磷酸酶b类似蛋1.2.2 原核表达载体构建白calcineurinb-likeprotein,cbl,cbl钙感受器将pgex-4t-3载体质粒用bamh和ecor2+含有4个可以结合ca 的ef手型结构域,是一类进行双酶切,将pet28载体质粒用nco和xho10?11小分子的钙结合蛋白cbl钙感受器与钙调进行双酶切.琼脂糖电泳后,切胶纯化回收具有双素cam类似,是一类依赖型感受器,本身不具有酶酶切识别位点的pgex-4t-3和pet28质粒片段.2+活性,在ef手型

10、结构域结合ca 后,通过与其相通过pcr扩增,在cipk7基因的编码区两端互作用的蛋白激酶发生分子间作用,激活蛋白激12 分别加上bamh, ecor酶切位点以下划线标酶活性,以蛋白质复合体的形式发挥其功能出: cipk7上游引物primerf:5-ggatccatgg植物中, 蛋白激酶cipkcbl-interacting proteinaatcacttccccagccg-3,下游引物primerr:kinase, cipk家族能够与cbl钙感受器发生特异5-gcggaattcttacatgatgtcattgtgcca性结合. cipk蛋白激酶c端结构域的naf/fishtga-3. 将pc

11、r产物连接pmd18-t载体,检测阳序列是其与cbl蛋白相互作用必需的最小基性克隆进行双酶切.琼脂糖电泳后,切胶纯化回13?14序,磷酸化位点存在于n端的激酶结构域收带有bamh, ecor酶切位点的cipk7基因cbl-cipk复合体在植物响应环境胁迫的信号转片段, 与已经用bamh, ecor双酶切后纯化14?15导方面发挥了重要作用cbl4-cipk24参与植物盐胁迫信号转导 , cbl9-cipk3诱导物转化e. coli dh5宿主菌. 经pcr法、酶切法检18植物aba的生物合成 , cbl1-cipk14参与植物对光反应的信号途径 , cbl1-cipk1在调节植20 为pgex

12、-4t-3-cipk7.物干旱、渗透胁迫信号通路中发挥重要作用通过pcr扩增,在cbl1基因的编码区两端本文是在酵母双杂交试验的基础上, 通过分别加上nco和xho的酶切位点以下划线标gst pull-down技术进一步验证cipk7与cbl1之出: cbl1上游引物primerf:tattccatgggct间的相互作用,为进一步研究cbl1-cipk7蛋白gcttccactcaaa-3, 下游引物primerr: 5-质复合体在药用植物次生代谢信号通路中的作用,ttctcgagtgtggcaatctcatcgacc t-3.探索药用植物对环境因子的适应机制奠定基础.与已经用nco, xho

13、双酶切后纯化回收1 材料与方法的pet28质粒片段作连接反应.方法同上,构建1.1 材料质粒pet28-cbl1.大肠杆菌e. coli dh5, bl21de3和rosetta1.2.3 融合蛋白的诱导表达与纯化de3为实验室保存菌种. pgex-4t-3质粒,将构建好的pgex-4t-3-cipk7质粒转化大肠pet28质粒为实验室保存质粒. rna提取试杆菌rosettade3宿主菌. 从转化了pgex-4t-3-剂盒、dna电泳凝胶回收试剂盒、dna marker、蛋cipk7的rosettade3阳性菌落中挑取单菌落,白分子量marker购自tiangen公司. 限制性内切接种于5m

14、l含100mg/lamp和34mg/lchl的lb司.液分别转接于两支10ml含100mg/lamp和34mg/l1.2 试验方法chl的lb液体培养基中, 28 c振荡培养, 测1.2.1 cipk7和cbl1基因克隆od ,在od 达到0.6时,其中向一支试管中加600 60021rna,反转录为cdna作为模板,进行pcr扩增振荡培养4, 6, 8h后分别取1ml菌液, 12000r/min扩增cipk7基因cds全长, 上游引物primerf: 离心1min, 收集菌体. 用50ldh o重悬菌体,2830 兰州大学学报(自然科学版) 第49卷加入50后, 剧烈刮悬, 以使dna长链断

15、裂, 减小黏度. 完全正确.12000r/min离心5min后, 取上清液进行sds-page电泳检测. 挑选最佳诱导时间, 按照预诱导的条件进行gst-cipk7蛋白的大量诱导表达. pet28-cbl1质粒转化bl21de3宿主菌,用含有50mg/lkan的lb液体培养基培养转化有pet28-cbl1b的阳性单克隆菌落, iptg诱导表达cbl1-his融合蛋白将大量诱导的菌液4000r/min, 4 c离心1 pcr扩增鉴定; 2重组质粒pgex-4t-3-cipk7的10min. 弃上清,收集菌体,用结合缓冲液清洗重bamh, ecor双酶切; m marker悬.超声破碎细胞后,12

16、000r/min,4 c离心5min,图 1 重组质粒pgex-4t-3-cipk7的pcr及酶切鉴定m滤膜过滤后, 用于蛋figure 1 identi?cation of the recombinant plasmid白质的纯化. gst-cipk7融合蛋白利用谷胱甘pgex-4t-3-cipk7 by pcr and enzyme肽gst琼脂糖亲合层析柱,进行亲合层析纯化.digestioncbl1-his融合蛋白利用组氨酸标记亲合层析柱进2.2 pet28-cbl1原核表达载体的构建行亲合层析纯化.pcr扩增获得带有nco, xho酶切位点.4 gst pull-down实验的cbl1

17、基因cds全长编码序列624个碱基对,向3支装有谷胱甘肽琼脂糖glutathioneseph-213个氨基酸, 将酶切产物插入nco, xhoarose 4b4b的纯化柱中加入结合缓冲液50mmol/l双酶切的pet28载体中. 重组质粒pet28-cbl1tris-hcl, ph7.4, 100mmol/lnacl,平衡5个柱体的pcr及酶切鉴定结果如图2. pcr及酶切鉴定结果,经琼脂糖凝胶电泳检测,目的条带大小相符.裂解液,其中2支加入pgex-4t-3-cipk7大量诱测序结果表明,重组质粒中插入的序列完全正确.导gst-cipk7后的菌裂解液,另1支加入pgex-4t-3大量诱导gs

18、t后的菌裂解液.放置于4 c,水平振荡仪上,缓慢上下颠倒以增加裂解液与柱材的接触,促进结合. 2?4h后,弃掉裂解液,用预冷的结合缓冲液冲洗5?8次. 再将pet28-cbl1大量诱导的菌裂解液超声破碎,离心过滤后分别加入1支结合gst-cipk7和1支结合gst的柱子中. 同样4 c,上下缓慢振荡2?4h. 弃裂1 pcr扩增鉴定; 2重组质粒pet28-cbl1的nco,解液,用结合缓冲液冲洗5?8次后,用洗脱缓冲xho双酶切; m marker液50mmol/ltris-hcl, ph7.4, 10mmol/lnacl,图 2 重组质粒pet28-cbl1的pcr及酶切鉴定10mmol/

19、l还原性谷胱甘肽洗脱3支纯化柱,收集figure 2 identi?cation of the recombinant plasmid样品,用于sds-page和western blot免疫印迹分pet28-cbl1 by pcr and enzyme digestion析.2.3 gst-cipk7融合蛋白的诱导表达与纯化2 结果pgex-4t-3-cipk7重组阳性质粒转化e. coli2.1 pgex-4t-3-cipk7原核表达载体的构建, ecor点的cipk7基因cds全长编码序列1290个碱基 肠杆菌, 超声后上清用glutathione-sepharose 4b对, 429个氨

20、基酸,将酶切产物插入bamhi, ecor 亲和层析法纯化, sds-page检测结果见图3. 用双酶切的pgex-4t-3载体中.重组质粒pgex-4t- glutathione-sepharose 4b亲合层析柱纯化大量诱3-cipk7的pcr及酶切鉴定结果如图1. pcr及 导表达的gst-cipk7蛋白,得到大小约为76kd酶切鉴定结果,经琼脂糖凝胶电泳检测,目的条带 的融合蛋白,仅部分可溶表达.大量纯化的gst-第6期 黄聪琳,等:gst pull-down技术验证cipk7蛋白激酶与cbl1蛋白的相互作用 831cipk7蛋白将用于gst pull-down试验. 不能与阴性对照g

21、st结合泳道2, 说明cipk7与cbl1存在体外的相互作用.1 iptg诱导的阳性克隆; 2未加iptg诱导的阴性对照; 3, 4 glutathione-sepharose 4b纯化得到的gst-上图: 考马斯亮蓝染色的sds-page;下图: 用his标签cipk7融合蛋白; m marker的抗体检测的western blot免疫印迹分析.图 3 gst-cipk7融合蛋白的原核表达与纯化1 gst-cipk7与cbl1-his的pull-down产物; 2 gstfigure 3 prokaryotic expression and puri?cation of与cbl1-his的p

22、ull-down产物; 3 用于pull-down实验的gst-cipk7; 4纯化的cbl1-hisfusion protein gst-cipk72.4 cbl1-his融合蛋白的诱导表达与纯化图 5 cipk7与cbl1的pull-down试验figure 5 pull-down assay of cipk7 and cbl1pet28-cbl1重组阳性质粒转化e. coli bl21de3菌株, 应用终浓度为0.5mmol/l的iptg,3 讨论28 c诱导表达过夜.富集诱导表达的大肠杆菌,本实验构建了pgex-4t-3-cipk7和pet28-超声后上清用组氨酸标记亲合层析柱纯化,

23、sds-cbl1原核表达载体.在转化大肠杆菌e. coli bl21诱导表达目的蛋白的过程中, 发现pgex-4t-3-纯化大量诱导表达的cbl1-his蛋白,得到大小约cipk7质粒在e. coli bl21菌株中,通过iptg诱导,不能大量表达gst-cipk7蛋白. 考虑到在大的cbl1-his蛋白将用于gst pull-down试验.肠杆菌中表达植物真核蛋白,可能由于大肠杆菌密码子使用频率的限制,真核蛋白表达存在困难,因此,对cipk7基因序列进行了稀有密码子的分析.分析表明cipk7基因序列中,在第43, 69, 72,200, 241, 268, 333, 334, 377, 37

24、9密码子位置含有编码arg的稀有密码子agg, aga或者cga,其中在第333, 334位置为连续的两个重复;在第155,177, 284密码子位置含有编码leu的稀有密码子cta;在第70, 86, 256, 420密码子位置含有编1 iptg诱导的阳性克隆; 2组氨酸标记亲合层析柱纯化得到的cbl1-his融合蛋白; m marker码ile的稀有密码子ata;在第5密码子位置含有图 4 cbl1-his融合蛋白的原核表达与纯化figure 4 prokaryotic expression and puri?cation of密码子.因此,实验换用可以满足一些稀有密码子fusion pr

25、otein cbl1-his表达的rosettade3菌株. 将pgex-4t-3-cipk72.5 gst pull-down试验转化大肠杆菌rosettade3菌株后,成功诱导表达并纯化得到了gst-cipk7融合蛋白.将gst-cipk7固定于glutathione-sepharose4b珠子上. 同时,另外固定gst诱导表达pgex- 药用植物在识别环境胁迫信号,并有效地运4t-3空载体作为阴性对照,分别沉淀经组氨酸 用自身的防御机制去适应不适宜的环境胁迫的过标记亲合层析柱纯化的cbl1-his蛋白. 反复 程中,通常会产生大量的次生代谢产物,药用植物洗涤后, 进行sds-page和w

26、estern blot免疫印 的次生代谢产物通常是中药的主要药效成分,因迹分析鉴定,用抗his标签抗体检测gst-cipk7 此逆境对中药次生代谢产物积累及道地药材的形与cbl1-his是否结合,结果如图5所示. cbl1-his 成具有至关重要的作用. cbl-cipk复合体在植能够与gst-cipk7在体外特异性结合泳道1,而 物抗逆的信号通路中起到识别并传递信号的作用,832 兰州大学学报(自然科学版) 第49卷而cipk7又隶属于第3类蔗糖非发酵相关蛋白 biochimica et biophysica acta, 2009, 17936:23985?992.激酶snf1-relate

27、dproteinkinases3,snrk3 ,可13 zhu j k,liu j,xiong l. genetic analysis of salttolerance in arabidopsis: evidence for a critical role激酶cipk7与cbl1蛋白的相互作用,对进一步of potassium nutritionj. the plant cell online,揭示cipk7在逆境胁迫过程中可能的糖积累方面1998, 107: 1181?1192.的作用奠定了基础.14 shi j, kim k, ritz o, et al. novel proteinki

28、nases associated with calcineurin b-like calcium参考文献sensors in arabidopsisj. plant cell, 1999, 1112:2393?2406.因素研究进展j.中国医药生物技术, 2011, 64:15 albrecht v, ritz o, linder s, et al. the naf291?294.domain de?nes a novel protein-protein interaction2+module conserved in ca -regulated kinasesj.物次生代谢产物研究中的应用j

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