ELISA的原理与应用

1、ELISA ELISA 知识简介知识简介 03/11/15 12021/3/27 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 1.ELISA的原理的原理 2.ELISA的类型的类型 3.试剂准备试剂准备:免疫吸附剂免疫吸附剂 结合物结合物 酶底物的准备酶底物的准备 4.对照设定对照设定 5.标本的采取和保存标本的采取和保存 6.结果判断结果判断 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 ELISA ELISA是一种免疫测定（是一种免疫测定（immunoassay,IAimmunoassay,IA） 。基础。基础: :抗抗 原或抗体的固相化及

2、抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的 底物后底物后, ,底物被酶催化成为有色产物底物被酶催化成为有色产物, ,产物的量与标本中受产物的量与标本中受 检物质的量直接相关检物质的量直接相关, ,由此进行定性或定量分析。由此进行定性或定量分析。 1.ELISA的原理的原理 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 酶免疫测定类型酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在这种固相酶免疫测定方法在19711971年最初建立时称为酶联免疫年最初建立时称为酶联免疫 吸附剂测定（吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorb

3、ent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay）, ,简称简称 ELISAELISA。 酶免疫技术酶免疫技术 酶免疫组化酶免疫组化 酶免疫测定酶免疫测定 均相酶免疫测定均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 液相酶免疫测定液相酶免疫测定 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 1.11.1抗原抗体反应抗原抗体反应 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态 平衡平衡,其反应式为其反应式为: Ag+Ab

4、AgAg+AbAgAbAb 抗体的亲和力（抗体的亲和力（affinityaffinity）, ,可以用平衡常数可以用平衡常数K K表示表示 :K=Ag:K=AgAbAbAgAb ,AgAgAb ,AgAbAb的解离程度与的解离程度与K K值有关。值有关。高高 亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非 常适合常适合,两者结合牢固两者结合牢固,不易解离。不易解离。解离后的抗原或抗体均能解离后的抗原或抗体均能 保持原有的结构和活性。保持原有的结构和活性。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 1.1.21.1

5、.2特异性特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点 之间。化学结构和空间构型互补关系之间。化学结构和空间构型互补关系, ,具有高度的特异性。具有高度的特异性。 测定某一特定的物质测定某一特定的物质, ,而不需先分离待检物。而不需先分离待检物。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 1.1.31.1.3最适比例最适比例 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 1.1.41.1.4敏感性敏感性 化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平 酶反应测定

6、法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍标记的免疫敏感度可提高数千倍, ,达达ng/mlng/ml水平水平 例如例如, ,HBsAgHBsAg, ,其敏感度可达其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 1.41.4免疫测定在临床检验中的应用免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原成份由于各种抗原成份,包括小分子的半抗原包括小分子的半抗原,均可用以制备特均可用以

7、制备特 异性的抗血清或单克隆抗体异性的抗血清或单克隆抗体,利用此抗体作为试剂就可检测利用此抗体作为试剂就可检测 标本中相应的抗原标本中相应的抗原,因此免疫测定的应用范围极广。因此免疫测定的应用范围极广。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 2 2ELISAELISA的类型的类型 ELISA ELISA可用于测定抗原可用于测定抗原, ,也可用于测定抗体。在这种测定方也可用于测定抗体。在这种测定方 法中有三个必要的试剂法中有三个必要的试剂: : （1 1）固相的抗原或抗体）固相的抗原或抗体, ,即即 免疫吸附剂免疫吸附剂 （immunosorbentimmunos

8、orbent）; ; （2 2）酶标记的抗原或抗体）酶标记的抗原或抗体, ,称为称为 结合物结合物 （conjugateconjugate）; ; （3 3）酶反应的底物。）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 2.2.12.2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原, ,例如例如HBsAgHBsAg、 HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,

9、,就可用就可用 于于包被固相载体包被固相载体和制备和制备酶结合物酶结合物而建立此法。而建立此法。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 2.2.2 2.2.2 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检 标本不需稀释标本不需稀释, ,可直接用于测定可直接用于测定, ,因此其敏感度相对高于间因此其敏感度相对高于间 接法。乙肝标志物中抗接法。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg的检测常采用本法。本法关键的检测常采用本法。本法关键 在于酶标抗原的制备在于酶标抗原的制备, ,应根据抗原

10、结构的不同应根据抗原结构的不同, ,寻找合适的寻找合适的 标记方法。标记方法。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 2.2.3 2.2.3 间接法测抗体间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用 同一酶标抗抗体同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。建立检测相应抗体的方法。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 2.2.4 2.2.4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化或不易得到足够

11、的纯化 抗原时抗原时,可用此法检测特异性抗体。可用此法检测特异性抗体。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 2.2.5 2.2.5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点位点, , 因此不能用双抗体夹心法进行测定因此不能用双抗体夹心法进行测定, ,可以采用竞争法模式。可以采用竞争法模式。 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗 体结合。标本中抗原量含量愈多体结合。标本中抗原量含量愈多, ,结合在固相上的酶标抗原结合在固相

12、上的酶标抗原 愈少愈少, ,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISAELISA测定测定 多用此法。多用此法。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 2.2.6 2.2.6 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体 IgMIgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgMIgM抗体包被固相抗体包被固相, , 以捕获血清标本中的以捕获血清标本中的IgMIgM（其中包括针对抗原的特异性（其中包括针对抗原的特异性IgMIgM 抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒性感染的早期诊此法常

13、用于病毒性感染的早期诊 断。断。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 2.2.7 ABS-ELISA2.2.7 ABS-ELISA法法 : :固相支持物固相支持物; ; : :样品样品; ; : :特异性特异性IgGIgG; ; : :生物素化抗小鼠生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）; ; : :辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）; ; : :DABDAB显色液显色液; ; : :显色显色; ; 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3. E

14、LISA3. ELISA的试剂的试剂(A(A、B B、C C三部分三部分) ) ELISAELISA中有三个必要的试剂中有三个必要的试剂: :免疫吸附剂、结合物和酶的底免疫吸附剂、结合物和酶的底 物。物。 （1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）; ; （2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）酶标记的抗原或抗体（结合物）; ; （3 3）酶的底物）酶的底物; ; （4 4）阴性对照品和阳性对照品）阴性对照品和阳性对照品, ,参考标准品参考标准品; ; （5 5）结合物及标本的稀释液）结合物及标本的稀释液; ; （6 6）洗涤液）洗涤液; ; （7

15、 7）酶反应终止液）酶反应终止液 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 ELISAELISA的试剂准备的试剂准备A A 固相载体固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能, ,抗体或蛋抗体或蛋 白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高, ,但但 空白值也略高。空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好吸附性能好, ,空白值低空白值低, ,孔底透明度孔底透明

16、度 高高, ,各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近性能相近。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。 蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的, ,靠的靠的 是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团 间的作用。这种物理吸附是非特异性的间的作用。这种物理吸附是非

17、特异性的, ,受蛋白质的分子量受蛋白质的分子量 、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通 常含有更多的常含有更多的疏水基团疏水基团, ,故更易吸附到固相载体表面。故更易吸附到固相载体表面。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 不易吸附不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲 和层析作用和层析作用, ,包被在固相上的抗原纯度大大提高包被在固相上的抗原纯度大大提高, ,因此含杂质较因此含杂质较 多的抗原也可采用捕获包被法。多的抗原也可采用捕获

18、包被法。 亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体即用亲和素先包被载体, ,加入生物素化的加入生物素化的DNADNA, , 这种包被方法均匀、牢固这种包被方法均匀、牢固, ,已扩大应用于各种抗原物质的定量已扩大应用于各种抗原物质的定量 测定。测定。 脂类物质脂类物质无法与固相载体结合无法与固相载体结合, ,可将其在有机溶剂（例如乙醇可将其在有机溶剂（例如乙醇 ）中溶解后加入）中溶解后加入ELISAELISA板孔中板孔中, ,开盖置冰箱过夜或冷风吹干开盖置冰箱过夜或冷风吹干, ,待待 酒精挥发后酒精挥发后, ,让脂质自然干固在固相表面。让脂质自然干固在固相表面。 优点优点: :试验的特异性

19、、敏感性均由此得以改善试验的特异性、敏感性均由此得以改善, ,重复性亦佳重复性亦佳 。抗原用量少。抗原用量少, ,仅为直接包被的仅为直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 包被用抗原包被用抗原: : 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 一般只含有一个抗原决定簇一般只含有一个抗原决定簇, ,纯度高纯度高, ,特异性也高特异性也高, ,但由于分子量但由于

20、分子量 太小太小, ,往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的 吸附吸附, ,间接地结合到固相载体表面。间接地结合到固相载体表面。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.1.4 3.1.4 包被用抗体包被用抗体 IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力对聚苯乙烯有强吸附力, ,其联结发生在其联结发生在FcFc段上段上, ,抗体结合点抗体结合点 暴露于外。暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液. .须除去杂抗体后才能须除去杂抗体后才能 用于用于ELISAELISA,

21、,以保证试验的特异性。以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高腹水中单抗的浓度较高, ,特异性亦较强特异性亦较强, ,因此不需要作吸收层因此不需要作吸收层 析处理析处理, ,直接包被。在某些情况下直接包被。在某些情况下, ,用多种单抗混合包被用多种单抗混合包被, ,可取可取 得更好的效果。得更好的效果。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.1.5 3.1.5 包被的条件包被的条件 pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液 pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。 加入包

22、被液后加入包被液后, ,在在4-84-8冰箱中放置过夜冰箱中放置过夜, ,3737中保温中保温2 2小小 时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化, ,每批每批 材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的 包被浓度为包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.1.6 3.1.6 封闭封闭 封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液是继包被

23、之后用高浓度的无关蛋白质溶液 再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些 空隙空隙, ,从而排斥从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂常用封闭剂:0.05%-0.5%:0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶; ; 脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉比较价廉, ,可以高浓度使用（可以高浓度使用（5%5%）。）。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭固相均需封闭? ? 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本

24、标本 结果结果 3.4 3.4 洗涤液洗涤液 在板式在板式ELISAELISA中中, ,常用的稀释液为含常用的稀释液为含0.05%0.05%吐温吐温2020磷酸磷酸 盐缓冲液。盐缓冲液。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 ELISA的试剂准备的试剂准备B 3.2 3.2 结合物结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是即酶标记的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂 1 1酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性 3 3含有或少含有游离的抗体（或抗原）含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4 4结合物尚要有良

25、好的稳定性。结合物尚要有良好的稳定性。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.2.1 3.2.1 结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯度较高的IgG,IgG,以免在与酶联结时其以免在与酶联结时其 他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体, ,这样全部酶结合这样全部酶结合 物均具有特异的免疫活性物均具有特异的免疫活性, ,可以在高稀释度进行反应可以在高稀释度进行反应, ,实验实验 结果本底浅淡。在结果本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗原的模式不多中用酶标抗原的模式不多,

26、,总的要总的要 求是抗原必须是高纯度的。求是抗原必须是高纯度的。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.2.23.2.2酶酶 纯度高纯度高, ,催化反应的转化率高催化反应的转化率高, ,专一性强专一性强, ,性质稳定性质稳定, ,来源丰富来源丰富 , ,价格不贵价格不贵, ,受检标本中不存在相同的酶。受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力酶结合物保留活性部分和催化能力, ,底物易于制备和保存底物易于制备和保存, ,价价 格低廉格低廉, ,有色产物易于测定等。有色产物易于测定等。 在在ELISAELISA中中, ,HRPHRP, ,APAP

27、, ,葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶, ,-D-D-半乳糖苷酶和脲酶半乳糖苷酶和脲酶 等。等。 HRPHRP是一种糖蛋白是一种糖蛋白, ,含糖量约为含糖量约为18%18%, ,分子量为分子量为4400044000, ,是一种复是一种复 合酶合酶, ,由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成, ,是是 一种卟啉蛋白质。一种卟啉蛋白质。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.2.3 3.2.3 结合物的制备结合物的制备 酶标记抗体的制备方法主要有两种酶标记抗体的制备方法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸即戊二醛交联法和过

28、碘酸 盐氧化法。盐氧化法。 （1）戊二醛交联法戊二醛交联法: :戊二醛是一种双功能团试剂戊二醛是一种双功能团试剂, ,可使酶与蛋可使酶与蛋 白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%60%-70%）和重复）和重复 性好。性好。 交联反应是随机的交联反应是随机的, ,结合物的大小也不均一结合物的大小也不均一, ,酶与酶酶与酶, ,抗体抗体 与抗体之间也有可能交联与抗体之间也有可能交联, ,影响效果。影响效果。 （2 2）过碘酸氧化法）过碘酸氧化法: :适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRPHRP分分 子表面的多糖氧化为醛

29、基很活泼子表面的多糖氧化为醛基很活泼, ,可与蛋白质上的氨基形成可与蛋白质上的氨基形成 chiffchiff氏碱而结合。简便有效氏碱而结合。简便有效. . 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 结合物中混有的游离酶一般不影响结合物中混有的游离酶一般不影响ELISAELISA中最后的酶活性测中最后的酶活性测 定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原, ,因此因此 制备的酶结合物应予纯化制备的酶结合物应予纯化, ,去除游离的酶和抗体后用于检测去除游离的酶和抗体后用于检测, , 效果更好。效果更好。 制得结合物制

30、得结合物, ,最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度 时时, ,能维护一个低的本底能维护一个低的本底, ,并获得测定的最佳灵敏度并获得测定的最佳灵敏度, ,达到最合达到最合 适的测定条件和测定费用的节省。适的测定条件和测定费用的节省。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.2.43.2.4结合物的保存结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质酶和抗体均为生物活性物质, ,易失活。高浓度较为稳定易失活。高浓度较为稳定 , ,冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加 入

31、等体积的甘油入等体积的甘油, ,加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（ 例如庆大霉素）和防腐剂（例如庆大霉素）和防腐剂（HRPHRP结合物加硫柳泵结合物加硫柳泵, ,APAP结合物结合物 可加叠氮钠）。可加叠氮钠）。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.2.5 3.2.5 结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在 反应中直接吸附在固相载体上反应中直接吸附在固相载体上:0.1%:0.1%牛血清白蛋白牛血清白蛋白, , 0.05%0.05%

32、吐温吐温20 20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液, ,使用时使用时 不需再行稀释不需再行稀释, ,在在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个月。个月。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.3 3.3 酶的底物酶的底物 3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物 OPDOPD氧化后的产物呈橙红色氧化后的产物呈橙红色, ,用酸终止酶反应后用酸终止酶反应后, ,在在492nm492nm处有处有 最高吸收

33、峰最高吸收峰, ,灵敏度高灵敏度高, ,比色方便比色方便, ,是是HRPHRP结合物最常用的底物结合物最常用的底物 。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2为供氧体，为供氧体， H2O2为受氢体。为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。 E 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 TMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMB

34、TMB性质较稳定性质较稳定, ,可配成溶液可配成溶液 试剂试剂, ,只需与只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止后溶液混和即成应用液。酶反应终止后, ,TMBTMB产产 物由蓝色呈黄色物由蓝色呈黄色, ,可在比色计中定量可在比色计中定量, ,最适吸收波长为最适吸收波长为450nm450nm。 ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感敏感, ,但空白值极低但空白值极低, ,也为一些试剂盒所也为一些试剂盒所 采用。采用。 HRPHRP对氢受体的专一性很高对氢受体的专一性很高, ,仅作用于仅作用于H2O2H2O2、小分醇的过氧化、小分醇的过氧化 物和尿素过氧

35、化物物和尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 APAP的底物为磷酸酯酶的底物为磷酸酯酶, ,一般采用对一般采用对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作为作为 底物。产物为黄色的对硝基酚底物。产物为黄色的对硝基酚, ,在在405nm405nm波长处有吸收波长处有吸收 峰。用峰。用NaOHNaOH终止酶反应后终止酶反应后, ,黄色可稳定一时间。黄色可稳定一时间。APAP也也 有发荧光底物（磷酸有发荧光底物（磷酸4-4-甲基伞酮）甲基伞酮）, ,可用于可用于ELISAELISA作荧作荧 光测定光测定, ,

36、敏感度较高于用显色底物的比色法。敏感度较高于用显色底物的比色法。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 3.5 3.5 酶反应终止液酶反应终止液 常用的常用的HRPHRP反应终止液为硫酸反应终止液为硫酸, ,其浓度按其浓度按 加量及比色液的最终体积而异加量及比色液的最终体积而异, ,在板式在板式ELISAELISA 中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 4 4 对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和

37、阴性对照品(negative (negative control)control)是检验试验有效性的控制品是检验试验有效性的控制品, ,同时也作为判断结果的同时也作为判断结果的 对照。对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致, ,多以含多以含 蛋白保护剂的缓冲液为基质。蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称加入的量应与试剂的敏感度相称; ; 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较, ,可以估计标本物可以估计标本物 质的量。质的量。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备

38、对照对照 标本标本 结果结果 参考标准品参考标准品 定量测定（如甲胎蛋白质定量测定（如甲胎蛋白质, ,癌胚抗原测定等）应含有制作标癌胚抗原测定等）应含有制作标 准曲线用的参考标准品准曲线用的参考标准品, ,应包括覆盖可检测范围的应包括覆盖可检测范围的4-54-5个浓度个浓度 , ,一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中. . 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAgHBsAg检测的阴检测的阴 性对照品中不可含性对照品中不可含HBsAg,HBsAg,最好抗最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。 原理原

39、理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 5 5 标本的采取和保存标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或 抗原成份。抗原成份。 以血清标本为例以血清标本为例: :血浆中除尚含有血浆中除尚含有纤维蛋白原纤维蛋白原和和抗凝剂抗凝剂外外, ,其其 他成份同血清。血浆和血清可同等应用。他成份同血清。血浆和血清可同等应用。 血清标本应避免溶血血清标本应避免溶血: :红细胞溶解时会释放出具有过氧化物红细胞溶解时会释放出具有过氧化物 酶活性的物质酶活性的物质, ,以以HRPHRP为标记的为标记的ELIS

40、AELISA测定中测定中, ,可能会增加非特可能会增加非特 异性显色。异性显色。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 加样加样: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚次加样步聚, ,即加标本即加标本, ,加酶结合物加酶结合物, , 加底物。加样时应将所加物加在加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的底部板孔的底部, ,避免加避免加 在孔壁上部在孔壁上部, ,并注意不可溅出并注意不可溅出, ,不可产生气泡。不可产生气泡。 基本操作注意事项基本操作注意事项 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果

41、保温保温 抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)(incubation)。 ELISAELISA属固相免疫测定属固相免疫测定, ,抗原、抗体的结合只在固相表面上发抗原、抗体的结合只在固相表面上发 生。为什么生。为什么ELISAELISA反应总是需要一定时间的温育反应总是需要一定时间的温育? ? 温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）等（冰箱温度）等 。3737是实验室中常用的保温温度是实验室中常用的保温温度, ,也是大多数抗原抗体结合也是大多数抗原抗体结合 的合适温度。的合适温度。 原理原理

42、类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 保温方式保温方式:ELISA:ELISA仪器附有特制的电热块仪器附有特制的电热块, ,水浴。水浴。 若用保温箱若用保温箱: :ELISAELISA板放在湿盒内板放在湿盒内, ,在盒底垫湿的纱布在盒底垫湿的纱布, ,最后将最后将 ELISAELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放, ,以保证各板的温以保证各板的温 度都能迅速平衡。度都能迅速平衡。 室温温育的反应室温温育的反应, ,操作时的室温应严格限制在规定的范围内操作时的室温应严格限制在规定的范围内, , 标准室温温度是指标准室温温度是指20-252

43、0-25, ,但具体操作时可根据说明书的要但具体操作时可根据说明书的要 求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。 为保证这一点为保证这一点, ,一个人操作时一个人操作时, ,一次不宜多于两块板同时测定一次不宜多于两块板同时测定 。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 洗涤洗涤 洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤过程中虽不是一个反应步骤, ,但却也决定着实验但却也决定着实验 的成败。的成败。 ELSIAELSIA洗涤洗涤: :达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。达到分离游离的

44、和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质清除残留在板孔中游离的物质, ,以及非特异性地吸附的干扰物以及非特异性地吸附的干扰物 质。质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的, ,而在洗涤时又应把这种而在洗涤时又应把这种 非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 可以说在可以说在ELISAELISA操作中操作中, ,洗涤是最主要的关键技术。洗涤是最主要的关键技术。 洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外仪器配有特殊的自动洗涤仪外, ,手工手工 操作有操作有流水冲洗式和流水冲洗式和浸泡

45、式两种浸泡式两种: : 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 （1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤, ,洗洗 涤液为蒸馏水涤液为蒸馏水, ,自来水。洗涤效果更为彻底自来水。洗涤效果更为彻底, ,且也简便、快速且也简便、快速 。已有实验表明。已有实验表明, ,流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。 让水流冲击板孔表面让水流冲击板孔表面, ,洗涤效果更佳。洗涤效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂非离子

46、型洗涤剂 的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性疏水性的的, ,非非 离子型洗涤剂既含疏水基团离子型洗涤剂既含疏水基团, ,也含亲水基团也含亲水基团, ,使蛋白质回复到使蛋白质回复到 水溶液状态水溶液状态, ,从而脱离固相载体。从而脱离固相载体。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 显色显色 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的 温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内, ,阴性孔可保阴性孔可保 持

47、无色持无色, ,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度 有助于加速显色进行。有助于加速显色进行。 TMBTMB受光照的影响不大受光照的影响不大, ,可在室温中置于操作台上可在室温中置于操作台上, ,边反应观察边反应观察 结果。但为保证实验结果的稳定性结果。但为保证实验结果的稳定性, ,宜在规定的适当时间阅读宜在规定的适当时间阅读 结果。结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后作用后, ,约约4040分钟显色达顶峰分钟显色达顶峰, ,随即逐渐减弱随即逐渐减弱, , 至至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。 原理原理 类型

48、类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 比色比色 拭干板底附着的液体拭干板底附着的液体, ,然后将板正确放入酶标比色仪中。然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点以蒸馏水校零点, ,测读底物孔（未经任何反应仅加底物液测读底物孔（未经任何反应仅加底物液 的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的 孔）孔）, ,以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏 水校零点水校零点, ,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度, ,然后进然后进

49、 行计算。行计算。 结果以光密度（结果以光密度（oplical densityoplical density, ,ODOD）, ,现按规定用吸光度现按规定用吸光度 （absorbenceabsorbence, ,A A）, ,两者含义相同。通常的表示方法是两者含义相同。通常的表示方法是, ,将吸将吸 收波长写于收波长写于A A字母的右下角字母的右下角, ,如如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为492nm492nm, ,表示表示 方法为方法为AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 酶标比色仪酶标比色仪 酶

50、标比色仪简称酶标仪酶标比色仪简称酶标仪, ,通常指测读通常指测读ELISAELISA光度计。针对固相光度计。针对固相 载体形式的不同载体形式的不同, ,各有特制的适用于板、珠和小试管的设计各有特制的适用于板、珠和小试管的设计 。酶标仪的主要性能指标有。酶标仪的主要性能指标有: :测读速度、读数的准确性、重测读速度、读数的准确性、重 复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数 一般可精确到一般可精确到0.0010.001, ,准确性为准确性为1%1%, ,重复性达重复性达0.5%0.5%。 操作时室温宜在操作时室温宜在15-3015-30, ,使用前先预热仪器使用前先预热仪器15-3015-30分钟分钟, ,测读测读 结果更稳定。测读结果更稳定。测读A A值时值时, ,要选用产物的敏感吸收峰要选用产物的敏感吸收峰, ,如如OPDOPD用用 492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。波长。有的酶标仪可用双波长式测读。 各种酶标仪性能有所不同各种酶标仪性能有所不同, ,使用中应详细阅读说明书。使用中应详细阅读说明书。 原理原理 类型类型 试剂试剂 准备准备 对照对照 标本标本 结果结果 6 6 结果判断结果判断 6.1 6.1 定性测定定性测定 定性测定的结果判断作出定性测定