脂肪酸层析-WJ2014

1、1 实验实验02-1 02-1 油菜籽中不饱和脂肪酸的分离油菜籽中不饱和脂肪酸的分离 ( (反相纸层析法反相纸层析法) ) 2 n棕榈、大豆、油菜和向日葵是世界范围内最重要棕榈、大豆、油菜和向日葵是世界范围内最重要 的四大油料作物。的四大油料作物。 n脂肪酸分为脂肪酸分为饱和脂肪酸饱和脂肪酸和和不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸，其中不，其中不 饱和脂肪酸又分成饱和脂肪酸又分成单不饱和脂肪酸单不饱和脂肪酸和和多不饱和脂多不饱和脂 肪酸肪酸两种。两种。 n哺乳动物本身不能合成亚油酸（哺乳动物本身不能合成亚油酸（18:218:2 ）、亚麻酸）、亚麻酸 （18:318:3 ）和花生四烯酸（）和花生四烯酸（20

2、:420:4），必须从食物中），必须从食物中 获得，因此也称为获得，因此也称为“必须脂肪酸必须脂肪酸”。 3 乙酰乙酰CoACoA 脂肪酸合成脂肪酸合成 16:0 逐级羧化逐级羧化 18:0 软脂酸软脂酸 硬脂酸硬脂酸 18:0 硬脂酸硬脂酸 20:022:0 花生酸花生酸 22:113 山嵛酸山嵛酸 24:0 木蜡酸木蜡酸 芥酸芥酸 18:19 油酸油酸 18:29,12 亚油酸亚油酸 18:39,12,15 亚麻酸亚麻酸 18:36,9,12 亚麻酸亚麻酸 20:45,8,11,14 廿碳烯酸（花生四烯酸，廿碳烯酸（花生四烯酸，ARA） 双低油菜：低芥酸和低硫甙双低油菜：低芥酸和低硫甙 4

3、 一、实验目的一、实验目的 初步掌握用纸层析法测定油菜籽中脂肪酸的组初步掌握用纸层析法测定油菜籽中脂肪酸的组 成的方法成的方法 二、原理二、原理 在纸层析中，通常支持相是含水的，移动相是在纸层析中，通常支持相是含水的，移动相是 有机溶剂。脂肪酸用有机介质为支持相，以含有机溶剂。脂肪酸用有机介质为支持相，以含 水溶剂为移动相，也就是所谓水溶剂为移动相，也就是所谓“反相纸层析反相纸层析 法法”。 5 由于不同的脂肪酸在两相中的分配系数不同， 在层析滤纸上移动速率就有差异，最后使混合 脂肪酸的各组分被分开。然后用醋酸铜处理， 将脂肪酸转化为相应的铜盐，再用红氨酸显色， 即可得到蓝灰色点状层析图谱。

4、6 蓝灰色复合物蓝灰色复合物 7 三、材料、设备与试剂 （一）实验材料（一）实验材料 ：油菜籽油菜籽 （二）设备（二）设备 ：1. 1. 层析纸；层析纸；2. 2. 层析缸；层析缸；3. 3. 层层 析架；析架；4. 4. 显色盘；显色盘；5. 5. 电吹风；电吹风；6. 6. 微量进样微量进样 器或毛细管。器或毛细管。 8 （三）试剂 1.1.5%KOH-CH3OH5%KOH-CH3OH溶液溶液 2. 10%2. 10%液体石蜡液体石蜡- -石油醚溶液石油醚溶液 3. 3. 95%95%醋酸溶液醋酸溶液 4. 4. 1%1%醋酸铜溶液醋酸铜溶液 5. 5. 0.03%0.03%红氨酸红氨酸(

5、 (二硫代草酰胺二硫代草酰胺) )溶液溶液 6. 1 mol/L HCl6. 1 mol/L HCl 7. 7. 石油醚石油醚 9 四、实验步骤四、实验步骤 ( (一一) ) 样品制备样品制备 磨样：将磨样：将1 1克干燥的油菜种子放在研钵中研磨成克干燥的油菜种子放在研钵中研磨成 粉状，倒入磨口试管中加入粉状，倒入磨口试管中加入1mLKOH-CH3OH1mLKOH-CH3OH溶液，溶液， 25253030条件下放置条件下放置6 68 8小时（酯化）。加入小时（酯化）。加入 1mL1mol/LHCl1mL1mol/LHCl及及1mL1mL石油醚。石油醚。 10 ( (二二) ) 点样点样 在经石

6、腊油处理并晾干的层析纸一端在经石腊油处理并晾干的层析纸一端1.51.5 2cm2cm处用铅笔轻轻划一直线，每隔处用铅笔轻轻划一直线，每隔3cm3cm用铅笔用铅笔 轻轻点一记号并编号。轻轻点一记号并编号。 在层析纸各编号处，用毛细管取样品上清液在层析纸各编号处，用毛细管取样品上清液 0.01mL0.01mL，按编号顺序滴入点样处（每个点重，按编号顺序滴入点样处（每个点重 复点样复点样2 2 3 3）。）。 11 ( (三三) ) 展开溶剂系统与条件展开溶剂系统与条件 将点好样的层析纸固定，编号端朝下放入盛有将点好样的层析纸固定，编号端朝下放入盛有 醋酸溶液的层析缸中，醋酸溶液的多少以能浸醋酸溶液

7、的层析缸中，醋酸溶液的多少以能浸 泡层析纸但液面低于点样处为宜。泡层析纸但液面低于点样处为宜。至展层剂上至展层剂上 升到距滤纸顶端升到距滤纸顶端2/32/3处为止，取出层析纸，吹干。处为止，取出层析纸，吹干。 12 ( (四四) ) 显色显色 将吹干的层析纸将吹干的层析纸放入醋酸铜溶液中浸泡约放入醋酸铜溶液中浸泡约 20-3020-30秒，秒，使之生成脂肪酸铜盐。用清水冲洗，再使之生成脂肪酸铜盐。用清水冲洗，再 放入洁净的瓷盘中，用放入洁净的瓷盘中，用流水漂洗流水漂洗2020分钟分钟以上。以上。 将层析纸小心取出，放置在洁净的吸水纸上，用将层析纸小心取出，放置在洁净的吸水纸上，用 电吹风吹干。

8、电吹风吹干。 将吹干的层析纸在红氨酸溶液中将吹干的层析纸在红氨酸溶液中一带而过一带而过， 层析分离后的脂肪酸立即显出蓝灰色的斑点。层析分离后的脂肪酸立即显出蓝灰色的斑点。 13 五五. .结果分析结果分析 根据纸层析色谱上的斑点位置标出根据纸层析色谱上的斑点位置标出5 5种不饱种不饱 和脂肪酸。图谱中的顺序由下而上为：芥酸、和脂肪酸。图谱中的顺序由下而上为：芥酸、 廿碳烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸。廿碳烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸。 六、分析讨论六、分析讨论 根据结果比较不同油菜种子中芥酸含量的根据结果比较不同油菜种子中芥酸含量的 高低。高低。 14 亚麻酸亚麻酸 亚油酸亚油酸 油酸油酸 廿碳烯酸

9、廿碳烯酸 芥酸芥酸 15 实验实验02-2 02-2 油菜籽中硫代葡萄糖油菜籽中硫代葡萄糖 甙总量的快速测定甙总量的快速测定( (葡萄糖试纸法葡萄糖试纸法) ) 硫代葡萄糖甙（简称硫甙）是广泛存在 于十字花科植物中的一种含硫化合物，其结构 同时如下： 16 在植物体内硫代葡萄糖甙葡萄糖水解酶的在植物体内硫代葡萄糖甙葡萄糖水解酶的 作用下，会分解产生作用下，会分解产生异硫氰酸酯异硫氰酸酯、噁唑烷硫酮噁唑烷硫酮、 腈腈等剧毒物质，是影响油菜籽综合利用的重要等剧毒物质，是影响油菜籽综合利用的重要 限制因素。限制因素。“双低油菜双低油菜”指的就是指的就是“低芥酸低芥酸、 低硫甙低硫甙”。快速测定油菜籽

10、中硫代葡萄糖甙的。快速测定油菜籽中硫代葡萄糖甙的 含量，对于选育、筛选含量，对于选育、筛选“双低双低”油菜具有重要油菜具有重要 意义。意义。 17 一实验目的一实验目的 掌握快速测定油菜籽中硫甙的总量原理和方法掌握快速测定油菜籽中硫甙的总量原理和方法 二、实验原理二、实验原理 十字花科植物种子种含有硫甙和分解硫甙的硫十字花科植物种子种含有硫甙和分解硫甙的硫 甙酶，将油料种子经破碎后，加入适量的水，硫甙酶，将油料种子经破碎后，加入适量的水，硫 甙酶便可促使硫甙水解，每分子的硫甙经水解后甙酶便可促使硫甙水解，每分子的硫甙经水解后 产生一分子的葡萄糖，用葡萄糖试纸便可快速检产生一分子的葡萄糖，用葡萄

11、糖试纸便可快速检 测水解液中葡萄糖的含量，根据葡萄糖与硫甙的测水解液中葡萄糖的含量，根据葡萄糖与硫甙的 定量关系便可知待测样品中硫甙总量的高低。定量关系便可知待测样品中硫甙总量的高低。 18 固定化酶： 尿糖试纸：尿糖试纸： 葡萄糖在葡萄糖在葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶的催化作用下形成葡萄糖的催化作用下形成葡萄糖 酸和过氧化氢，过氧化氢在酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶过氧化氢酶的催化作的催化作 用下形成水和原子氧，原子氧可以将某种用下形成水和原子氧，原子氧可以将某种无色的无色的 化合物化合物氧化成有色的化合物，将上述两种酶和无氧化成有色的化合物，将上述两种酶和无 色化合物固定在纸条上，制成测试

12、尿糖含量的酶色化合物固定在纸条上，制成测试尿糖含量的酶 试纸。试纸。 19 三、材料、仪器设备及试剂三、材料、仪器设备及试剂 （一）材料（一）材料 油菜种子（高硫甙、低硫甙品种）油菜种子（高硫甙、低硫甙品种） （二）仪器设备（二）仪器设备 1. 1. 点滴板点滴板 2. 2. 玻棒玻棒 3. 3. 滴管滴管 （三）试剂（三）试剂 1. 1. 蒸馏水蒸馏水 2. 2. 葡萄糖试纸葡萄糖试纸 20 四、实验步骤四、实验步骤 分别取高硫苷、低硫苷油菜种子分别取高硫苷、低硫苷油菜种子5-105-10粒放入粒放入 点滴板中，用滴管各加入点滴板中，用滴管各加入3 35 5滴蒸馏水，用玻棒滴蒸馏水，用玻棒 捣碎后搅匀，将葡萄糖试纸浸入被测液中，捣碎