实验11__菊花组织培养试验

1、第四部分第四部分 浅尝现代生物技术浅尝现代生物技术 实验目的实验目的 1 1、进行菊花的组织培养、进行菊花的组织培养 2 2、尝试植物激素的应用、尝试植物激素的应用 通过必修课的学习，我们已经了解到大多 绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有 没有不用种子来培育植物的方法呢？ 组织培养组织培养 营养繁殖营养繁殖 扦插扦插 嫁接嫁接 压条压条 无性繁殖无性繁殖 一、基础知识分析一、基础知识分析 （一）组织培养的生殖方式（一）组织培养的生殖方式 离体器官、 组织或细胞 脱分化 愈伤组织 再分化 根、芽 植物体 （二）植物组织培养的基本过程（二）植物组织培养的基本过程 知识要点知识要点: : 1.

2、1.细胞分化的概念；细胞分化的概念； 2.2.离体植物细胞的脱分化和再分化。离体植物细胞的脱分化和再分化。 （三）影响植物组织培养的因素（三）影响植物组织培养的因素 影响植物组织培养的因素有培养基配制、影响植物组织培养的因素有培养基配制、 外植体的选取、消毒、接种、培养、移栽和外植体的选取、消毒、接种、培养、移栽和 栽培等。栽培等。 (1)(1)外植体选取：不同的植物组织外植体选取：不同的植物组织 同一植物的不同材料同一植物的不同材料 (2)(2)营养营养 (3)(3)环境条件环境条件(pH(pH、温度温度、光照光照) ) (4)(4)植物激素植物激素 (5)(5)消毒消毒 （四）生长素与细胞

3、分裂素使用配比对实验结果的影响（四）生长素与细胞分裂素使用配比对实验结果的影响 使用配比使用配比实验结果实验结果 细胞分裂素细胞分裂素 生长素浓度生长素浓度诱导芽的生成诱导芽的生成 细胞分裂素细胞分裂素= =生长素浓度生长素浓度愈伤组织继续生长而不分化愈伤组织继续生长而不分化 细胞分裂素细胞分裂素 生长素浓度生长素浓度诱导根的生成诱导根的生成 制备制备MS固体固体 培养基培养基 外植体消毒外植体消毒 接种接种 培培 养养 栽培栽培 移移 栽栽 二、实验操作二、实验操作 （一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基 1 1、配制母液、配制母液 按照按照MS培养基成分表培养基成分表, 分别配制

4、培养基的母液。分别配制培养基的母液。 (1)(1)大量元素母液大量元素母液(10(10倍液倍液) ) 分别称取分别称取1010倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml800ml 热的（热的（60-8060-80）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一 种，最后加水，定容至种，最后加水，定容至1000ml1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备 用）。用）。 (2)(2)微量元素母液微量元素母液(100(100倍液倍液) ) (3)(3)铁盐母液（铁盐母液（100100倍液）倍液

5、） (4)(4)有机物质母液有机物质母液(100(100倍数倍数) ) (5)(5)生长素母液生长素母液 (6)(6)细胞分裂素母液细胞分裂素母液 注意注意: :配制培养基时，一定要注意调节配制培养基时，一定要注意调节pHpH。 MSMS培养基配制方法培养基配制方法 你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物 培养基的配方相比，培养基的配方相比，MSMS培养基的配方有哪些明培养基的配方有哪些明 显的不同？显的不同？ 微量元素和大量元素提供植物细胞生活所微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐必需的无机盐； 蔗糖提供蔗糖提供碳源碳源，同时能够，同时能够维

6、持细胞的渗透压维持细胞的渗透压；甘氨酸、维；甘氨酸、维 生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径 受到一定影响后所产生的受到一定影响后所产生的特殊营养需求特殊营养需求。 微生物培养基以微生物培养基以有机营养为主有机营养为主。与微生物的培养不同，。与微生物的培养不同， MSMS培养基则需提供培养基则需提供大量无机营养大量无机营养，无机盐混合物包括植物，无机盐混合物包括植物 生长必须的大量元素和微量元素两大类。生长必须的大量元素和微量元素两大类。 (1) (1) 取取1000ml1000ml烧杯一只，加大量元素烧杯一只，加大量元素1010

7、倍母液倍母液 100ml100ml，微量元素，微量元素100100倍母液倍母液10ml10ml，铁盐，铁盐100100倍母液倍母液 10ml,10ml,有机物质有机物质100100倍母液倍母液10ml10ml。此外。此外, ,根据培养材料根据培养材料 和实验目的还要附加一定量的和实验目的还要附加一定量的生长素生长素, ,细胞分裂素细胞分裂素及蔗及蔗 糖等糖等, ,然后加水至然后加水至1000ml,1000ml,待蔗糖充分溶解后用待蔗糖充分溶解后用 1mol/L 1mol/L 的的NaOHNaOH或或HClHCl调酸碱度为调酸碱度为pH5.8,pH5.8,最后加入最后加入 琼脂粉琼脂粉6.5g,

8、6.5g,如用琼脂条如用琼脂条, ,则要加则要加8g8g。 2.2.培养基配制与分装：培养基配制与分装： (2)(2)将盛有培养基的烧杯在电磁炉上，煮至琼脂完全将盛有培养基的烧杯在电磁炉上，煮至琼脂完全 融化，补加蒸馏水至融化，补加蒸馏水至1000ml1000ml。 将配制好的培养基分装到培养用三角瓶中，每只将配制好的培养基分装到培养用三角瓶中，每只 100ml100ml三角瓶约装三角瓶约装40ml40ml培养基。培养基。 分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容 易引起杂菌污染。易引起杂菌污染。 （1 1）把装好的培养基的三角瓶放入高）把装好的

9、培养基的三角瓶放入高 压灭菌锅中，盖好锅盖。压灭菌锅中，盖好锅盖。 （2 2）设置灭菌温度参数为）设置灭菌温度参数为121121， 20min20min，开始灭菌。，开始灭菌。 3 3、灭菌、灭菌 无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键 （二）外植体（离体组织）消毒（二）外植体（离体组织）消毒 注意：注意：对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药 剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。 不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。不同药剂、不同植物

10、材料，甚至不同器官要区别对待。 1 1、7070酒精中浸泡酒精中浸泡10min10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗 2 2、5%5%次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗 3 3、用另一、用另一5%5%次氯酸钠溶液浸泡次氯酸钠溶液浸泡5min5min，无菌水冲洗，无菌水冲洗 4 4、超净台中用无菌水多次冲洗、超净台中用无菌水多次冲洗 （三）切段后接种（三）切段后接种 1 1、先用肥皂洗手，穿、先用肥皂洗手，穿 上工作服，戴上口罩和工上工作服，戴上口罩和工 作帽。作帽。 2 2、放入培养瓶和灭、放入培养瓶和灭 菌后的接种用具菌后的接种用具( (镊子、镊子、 解剖刀、接种针解剖

11、刀、接种针) )，把镊，把镊 子、解剖刀、接种针插入子、解剖刀、接种针插入 内盛内盛70%70%酒精的广口瓶酒精的广口瓶 中。中。 3 3、在酒精灯火焰旁，打、在酒精灯火焰旁，打 开三角瓶，把花茎用无菌解开三角瓶，把花茎用无菌解 剖刀切成几段，每段至少有剖刀切成几段，每段至少有 一张叶片一张叶片 4 4、切段插入培养基，诱、切段插入培养基，诱 导愈伤组织，盖上封口膜。导愈伤组织，盖上封口膜。 5 5、愈伤组织插入生芽培、愈伤组织插入生芽培 养基，盖上封口膜。养基，盖上封口膜。 6 6、用记号笔在瓶壁上写、用记号笔在瓶壁上写 明明培养材料培养材料、培养基代号培养基代号、 接种日期接种日期。 注意

12、事项注意事项 全部接种操作都是在无菌条件下进行的，所以全部接种操作都是在无菌条件下进行的，所以 要特别认真仔细，以防杂菌污染。要特别认真仔细，以防杂菌污染。 （四）培养（四）培养 接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培 养期间应定期消毒，温度控制在养期间应定期消毒，温度控制在55， 并且每日照光并且每日照光4.54.5小时小时 。观察记录生长情况，。观察记录生长情况， 并照相存档。并照相存档。 2 2-3 3周后将生长健壮的周后将生长健壮的丛状苗丛状苗在无菌条件下在无菌条件下 一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续

13、 培养培养 （五）移栽（五）移栽 （六）栽培（六）栽培 生根后，将苗移生根后，将苗移 至消毒的草炭土或蛭至消毒的草炭土或蛭 石中，用玻璃罩或塑石中，用玻璃罩或塑 料布保持料布保持80%80%以上湿以上湿 度，度，2 2- -3 3天后打开玻天后打开玻 璃罩低湿度锻炼璃罩低湿度锻炼 转移至土中培养转移至土中培养 （定植）（定植） 三、结果分析与评价三、结果分析与评价 （一）对接种操作中污染情况的分析（一）对接种操作中污染情况的分析 接种接种3 34 d4 d后，在接种操作中被杂菌污染的培养后，在接种操作中被杂菌污染的培养 物会表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，物会表现出被污染的现象。请学

14、生适时统计污染率， 分析接种操作是否符合无菌要求。分析接种操作是否符合无菌要求。 （二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化 观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记 录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤 组织进一步分化成根和芽的比例和时间。组织进一步分化成根和芽的比例和时间。 （三）是否进行了统计、对照与记录（三）是否进行了统计、对照与记录 做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学 态度。从实验的第一步开

15、始就要求做好实验记录，实验态度。从实验的第一步开始就要求做好实验记录，实验 小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培 养基，然后做不同配方的比较。养基，然后做不同配方的比较。 （四）生根苗的移栽是否合格（四）生根苗的移栽是否合格 生根苗移栽技术的生根苗移栽技术的关键关键是既要充分清洗根系表面是既要充分清洗根系表面 的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的 办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒 质量分数为质量分数为5%5%的高锰酸钾，并用塑料

16、薄膜覆盖的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12 h12 h。 掀开塑料薄膜后掀开塑料薄膜后24 h24 h才能移栽。新移栽的组培苗要才能移栽。新移栽的组培苗要 在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。 学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽 是否合格。是否合格。 四、本课题知识小结四、本课题知识小结 菊花的组织培养菊花的组织培养 原理：细胞的全能性原理：细胞的全能性 条件条件 基础基础 概念概念 植物组织培养植物组织培养 的基本过程：的基本过程： 环境因素环境因素（温度、（温度、PH、光照）、光照）

17、 外植体的选择外植体的选择 营养因素营养因素 植株植株根、芽根、芽 愈伤愈伤 组织组织 外植体外植体 影响植物组织影响植物组织 培养的因素培养的因素 植物激素配比植物激素配比 实验过程：实验过程：移栽移栽栽培栽培培养培养接种接种 外植体外植体 消毒消毒 制备制备 MS培培 养基养基 五、练习五、练习 植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对 培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合 于某些微生物的生长，如于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长一些细菌、真菌等的生长。而培养。

18、而培养 物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要 进行严格的无菌操作。进行严格的无菌操作。 外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件 之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化 和再分化。和再分化。 在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列 的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？ 在选取菊花茎段的时候，为什么要选取生长旺盛的在选取菊花茎段的时候，为什么要选取生长旺盛的

19、嫩枝？嫩枝？ 3 3、不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可以使用与本实验相、不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可以使用与本实验相 同的生长素和细胞分裂素浓度同的生长素和细胞分裂素浓度 4 4、本实验用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为、本实验用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为 什么？什么？ 5 5、如果在自然界取植物样本进行组织培养，你认为应采取什么措、如果在自然界取植物样本进行组织培养，你认为应采取什么措 施保证样本不被污染？施保证样本不被污染？ 任何植物物种或品种都不可贸然使用与本实验相同的生长素任何植物物种或品种都不可贸然使用与本实验相同的生长素 和细胞分裂

20、素浓度和细胞分裂素浓度，必须要套索使用如何合成激素和何种激，必须要套索使用如何合成激素和何种激 素浓度才可以。学习者可以参考已有文献上成熟的经验，也素浓度才可以。学习者可以参考已有文献上成熟的经验，也 可以自己探索可以自己探索 植物中存在的天然激素有相应的使之分解的酶植物中存在的天然激素有相应的使之分解的酶，这样，天，这样，天 然激素在植物体内作用和然激素在植物体内作用和存在的时间就较短存在的时间就较短，而，而人工合成人工合成 的激素在植物中没有相应使之分解的酶的激素在植物中没有相应使之分解的酶，所以作用和存在，所以作用和存在 时间长，作用效果也更明显。时间长，作用效果也更明显。 （1 1）操

21、作环境洁净（）操作环境洁净（2 2）植物样本洁净（）植物样本洁净（3 3）操作过程无菌）操作过程无菌 因为污染物的来源是操作过程中和植物本身带来的，主要是因为污染物的来源是操作过程中和植物本身带来的，主要是 微生物的污染，要采用各种措施防止微生物污染，具体做法微生物的污染，要采用各种措施防止微生物污染，具体做法 和操作在微生物培养实验中已经介绍。除认真消毒除菌外，和操作在微生物培养实验中已经介绍。除认真消毒除菌外， 操作敏捷迅速，也可以降低污染率操作敏捷迅速，也可以降低污染率 6 6右图为植物体细胞杂交过程示意图。右图为植物体细胞杂交过程示意图。 据图回答：据图回答： （1 1）步骤是）步骤是 ，最，最 常用的方法是常用的方法是 。 （2 2）步骤一般常用的化学试剂）步骤一般常用的化学试剂 是是 ，目的是，目的是 。 (3)(3)在利用杂种细胞培育成为杂种植在利用杂种细胞培育成为杂种植 株的过程中，运用的技术手段株的过程中，运用的技术手段 是是 ，其中步骤相当于，其中步骤相当于 ，步骤相当于，步骤相当于 。 （4 4）植物体细胞杂交的目的是获得新）植物体细胞杂交的目的是