镰刀型细胞贫血症基因的检测方法

1、湖北当阳一中 沈满弟 限制性内切酶分析法是利用限制性 内切酶和特异性 DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的 改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。女如：（ 2005湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生 了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是A.解旋酶B.DNA连接酶C.限制性内切酶 D.RNA聚合酶解析：根据 碱基互补配对原则可采用DNA分子杂交原理或 DNA探针的方法。采用加热等 一定的技术手段将患者的 DNA分子片 段与正常人的DNA分子片段单链放在一起， 互补的碱基

2、 序 列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位 则仍然是两条游离的单链。 解 旋酶的作用是DNA分子在复 制或转录时将 DNA双链解开，在本题中加热也可以解开达 到目的， 所以不是必须的酶；DNA连接酶和限制性内切酶 都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子的基本骨架上脱氧核糖和 磷酸之间的磷酸二酯键，DNA连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而RNA聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成 mRNA分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故选Co根据DNA分子杂

3、交原理知，将患者的DNA分子片段与正常人的 DNA分子片段单链放在 一起，互补的碱基序列就会结合在一起， 形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将 其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。2008天津30- I下图为人B-珠蛋白基因与其mRNA杂交的示意图， -表示基因的不同功能区。从本题看出基因的单链的编 码区与其转录的成熟的 mRNA之间可以杂交形成杂合链， 但 是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子 对应的单链部分 一一所含有的上 百个核苷酸，mRNA 根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能 够杂交，只

4、 不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血 症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成 杂合链吗？应该是肯定 可以,如果这样来检测，那镰刀型细 胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两 短段，也同同一种酶来 切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰 刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的 限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的 mRNA进行

5、杂交（此过程可以不用任 何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳， 如果出 现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是 突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。利用相关知识点命题的请看如下高考试题。2007江苏38单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型 细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传 病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为 bb。有一对夫妇被检测出均为该致病 基因的携带者，为了能 生下健康的孩子，每次妊娠早期都 进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示 意图。（1）从图中可见，该基因突变是由于

6、碱基对改变（或A 变成T）引起的。巧合的是，这个位 点的突变使得原来正常 基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3个酶切位点，突 变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后， 凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示 2条，突变基因显示 1条。DNA或 RNA分子探针要用 放射性同位素（或荧光分子等）等标记。 利用核酸分子杂交 原理，根据图中突变基因的核苷酸序列 （ACGTGTT）写出作为探针的核糖核苷酸序 列UGCACAA 。（3）根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4次妊娠的胎儿H -l11-4中基因型 BB的个体是 一 I和口

7、一 4 , Bb的 个体是一 3 , bb的个 体是一 2。解析：比较基因B 和和突变后的基因b的碱基组成，发现它们的差别仅是 B基 因一条链某一位点上的碱基A突变成b基因一条链某一位 点上的碱基T （实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。据图观察，正常基因 B经限制酶切割后，凝胶电泳分 裂酶切片段，与 探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条， 而突变后的基因b经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。所以，在分析推断胎儿口-1H -4的基因型时，可以这 样认为：基因型Bb的个体同时带有 B 基因和b基因，所以其应同时含有与 B基因对应的二 条带 谱，与b基因对应的一条带谱（

8、这也可以从I-1和I -2得到验证）。符合这个条件的仅 有口 -3。同理，基因型为BB的 个体应仅有与B基因相对应的二条带谱，符合条件的是H -1和口 -4。bb的个体是只能是含有与 b基因相对应的一条带 谱，为H -2。作为探针的必要条 件之一是要易于识别，所以 可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。既可以用脱氧核 苷酸 链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明 确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要 注意当DNA链上的碱基是A时，作探针用的RNA链上的碱基应为 U。通过如 上分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特 异性DNA探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两种技术的综合分析方法。核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界 环境的控制来代替。限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，女口：在柯萨奇 B组病毒B1-B6型检测及分型中的应用 -利用GCG软件对柯萨奇B1-B6型病毒cDNA全序列进 行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题 也是