南京工业大学-高效液相色谱法

1、以液体作为流动相的色谱过程以液体作为流动相的色谱过程 概述概述 定义定义 高效液相色谱高效液相色谱 概述概述 特点特点 高压高压-150 350 x 105 Pa 高速高速-小于小于1h 高效高效-3万塔板万塔板/米（气相色谱米（气相色谱2000塔板塔板/米）米） 高灵敏度高灵敏度-10-910-11 g 概述概述 特点特点 气相色谱气相色谱 惰性气体（无亲 和性,只起运载作 用） 气体、沸点较低 的化合物 分析温度较高 GC和和HPLC 比较比较 液相色谱液相色谱 不同极性的液体 （有一定亲和作用） 高沸点、不稳定 的天然产物、生物 大分子、高分子化 合物 一般室温 在所有色谱技术中在所有色

2、谱技术中,液相色谱法是最早（液相色谱法是最早（1903年）发明年）发明 的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色 谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。 到了到了20世纪世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气年代后期，将已经发展得比较成熟的气 相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱 得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和 高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实

3、现了高高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高 效化和高速化。效化和高速化。 具有这些优良性能的液相色谱仪于具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，年商品化。从此， 这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效 液相色谱法（液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法），也称高压液相色谱法 或高速液相色谱法。或高速液相色谱法。 气相色谱适合分析较易挥发、且化学性质气相色谱适合分析较易挥发、且化学性质 稳定的有机化合物稳定的有机化合物; 而而HPL

4、C则适合于分析那些用气相色谱难则适合于分析那些用气相色谱难 以分析的物质以分析的物质,如挥发性差、极性强、具有如挥发性差、极性强、具有 生物活性、热稳定性差的物质。生物活性、热稳定性差的物质。 现在，现在，HPLC的应用范围已经远远超过气的应用范围已经远远超过气 相色谱，位居色谱法之首。相色谱，位居色谱法之首。 分析对象分析对象 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色 谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色 谱法四大类。谱法四大类。 按分离机理按分离机理,有的相同或部分重叠。但这些有的相同或部分重叠。但这些 方法或是在应用对象

5、上有独特之处，或是方法或是在应用对象上有独特之处，或是 在分离过程上有所不同，通常被赋予了比在分离过程上有所不同，通常被赋予了比 较固定的名称。较固定的名称。 高效液相色谱的类型高效液相色谱的类型 高效液相色谱的类型高效液相色谱的类型 HPLC按分离机理的分类按分离机理的分类 类类 型型主要分离机理主要分离机理主要分析对象或应用领域主要分析对象或应用领域 吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备 分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备 凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定 离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析 离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、

6、醇、醛分析 离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析 疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化 手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化 亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析 液相色谱仪单元组件液相色谱仪单元组件 基本组件基本组件 高压输液泵高压输液泵 色谱柱色谱柱 检测器检测器 数据系统数据系统 记录仪记录仪 积分仪积分仪 色谱工作站色谱工作站 其余组件其余组件 在线脱气装置在线脱气装置 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 自动进样系统自动进样系统 全自动控制系统全自动控制系统 柱后反应系统柱后反应系统 液相色谱仪的工作流程液相色谱仪的工作流程 输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送

7、至分析体系输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系 1 进样器将样品导入色谱柱前，流动相将样品带入色谱柱进样器将样品导入色谱柱前，流动相将样品带入色谱柱 2 各组分在色谱柱中分配系数或吸附力大小的不同而被分离各组分在色谱柱中分配系数或吸附力大小的不同而被分离 3 各组分依次随流动相流至检测器，产生检测信号各组分依次随流动相流至检测器，产生检测信号 4 数据系统记录、处理或保存信号。数据系统记录、处理或保存信号。 5 液相色谱流程图液相色谱流程图 PUMP Detector W Data station (Recorder) or Collection 基本理论和条件选择基本理论和条件

8、选择 理理 nLH/ 22 21 2 )(16)(54. 5)( W t W tt n RRR 理 effeff nLH/ 2 21 2 )(54. 5)(16 W t W t n RR eff 0 t t k R 2 ) 1 ( k k nneff 理 （填充柱）：uCuBAHGC/ （毛细管柱）或uCuBH/ dpA2dpA gm DDB22 gR DBtB， M T D T D gg 或 参参 数数气气 体体液液 体体 扩散系数扩散系数Dm/cm2s-110-110-5 密度密度/gcm-310-31 粘度粘度/g（cms）-110-410-2 影响扩散的主要物理性质影响扩散的主要物理性

9、质 pdHe2 HPLCHPLC 涡流扩散项涡流扩散项: md d DC H纵向扩散项纵向扩散项: 传质阻力项传质阻力项: 固定相传质阻力项:HS 流定相传质阻力项:Hm s fs D dC Hs 2 m pm m D dC H 2 流动的流定相传质阻力项:Hm 滞留的流定相传质阻力项:Hsm m psm sm D dC H 2 H = He + Hd + Hs+ Hm + Hsm s fs D dC 2 m pm D dC 2 m psm D dC 2 H =pd2 + mdDC + + uCuBAH/ v 提高填料装填的均匀性提高填料装填的均匀性 v 减小填料的粒度减小填料的粒度 v 低粘

10、度的流动相的使用低粘度的流动相的使用 v 适当提高柱温适当提高柱温 v 降低流速降低流速 提高液相色谱分离效率的方法提高液相色谱分离效率的方法: v 柱前峰展宽柱前峰展宽:进样引起进样引起 v 柱后峰展宽柱后峰展宽:接管、检测器的流通池体积引起接管、检测器的流通池体积引起 1. 固定相与装柱方法的选择固定相与装柱方法的选择: 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m） 首选化学键合相首选化学键合相,匀浆法装柱匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇，甲醇， 约约1ml/min 3.

11、柱温的选择：选室温柱温的选择：选室温25左右左右 一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法（三、离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法（四、空间排阻色谱法（SEC） （ s

12、teric exclusion chromatography 1分离机制分离机制:利用溶质分子占据固定相表面吸附利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异活性中心能力的差异 分离前提分离前提:K:K不等或不等或k k不等。不等。k k大大, ,保留值大。保留值大。 作用机制作用机制: :溶质分子和溶剂分子对吸附剂活性表面的溶质分子和溶剂分子对吸附剂活性表面的 竞争吸附。竞争吸附。 n n SaXm SmXa K Xm+nSa Xa+nSm 适用范围适用范围:分子质量中等的油溶性分子质量中等的油溶性 试样。对具有不同官能团的化合试样。对具有不同官能团的化合 物和异构体有较高的选择性。物和

13、异构体有较高的选择性。 缺点缺点:拖尾严重拖尾严重 概念概念:流动相和固定相都是液体流动相和固定相都是液体,但互不相溶，两者之间但互不相溶，两者之间 有一个明显的分界面。有一个明显的分界面。 1分离机制分离机制:利用组分在两相中溶解度的差异利用组分在两相中溶解度的差异 2固定相：载体固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液固定液极性极性NLLCNLLC 固定液固定液非极性非极性RLLCRLLC s m V V kK 3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱,极性大

14、的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 固定相极性固定相极性 底剂底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂） 例：水例：水 + + 甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，THFTHF 4流动相极性与流动相极性与k的关系的关系: 流动相极性流动相极性,洗脱能力洗脱能力，k，组分，组分tR 5出柱顺序出柱顺序:极性大的组分先出柱极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱 6适用：非极性适用：非极性中等极性组分（中等极性组分（HPLC80%问题）问题） （三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱 1分离机制分离机制:溶质分子与固定相之间定向作用力、溶质分子与固定相之间定向作

15、用力、 诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力 2固定相固定相:极性大的氰基或氨基键合相极性大的氰基或氨基键合相 3流动相：极性小（同流动相：极性小（同LSC） 底剂底剂 + 有机极性调节剂有机极性调节剂 例：正己烷例：正己烷 + + 氯仿氯仿- -甲醇甲醇, ,氯仿氯仿- -乙醇乙醇 4流动相极性与流动相极性与k的关系的关系: 流动相极性流动相极性,洗脱能力洗脱能力，组分，组分tR，k 5出柱顺序出柱顺序:结构相近组分，极性小的组分先结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱出柱极性大的组分后出柱 6适用：适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）氰基键合相与硅胶的柱选择

16、性相似（极性稍小） 分离物质也相似分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等 1 1反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（IPCIPC或或PICPIC） 反相色谱中反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加与其中的反离子形成中性离子对，增加k和和tR，以改善分离，以改善分离 1）离子对试剂）离子对试剂:烷基磺酸钠烷基磺酸钠分析碱分析碱 四丁基季胺盐四丁基季胺盐分析酸分析酸 2）影响k的因素 a与与m的极性有关（同反相色谱）的极性

17、有关（同反相色谱） b与与R的链长有关的链长有关:R长长,极性极性小，小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱 反相离子对色谱反相离子对色谱 RP-Ion-Pair HPLCRP-Ion-Pair HPLC Minutes 02468101214 Volts -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Volts -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Mg Cd Zn Chromatogram of Mg, Cd and Zn separation 2 2反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱 在反相色谱中在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相通过加入缓冲

18、溶液调节流动相pH 值，抑制组分解离，增加其值，抑制组分解离，增加其k和和tR，以达到改善，以达到改善 分离的目的分离的目的 1）离子抑制剂）离子抑制剂:弱酸、弱碱性物质弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液 2）k的影响因素的影响因素:与流动相极性有关与流动相极性有关,还与还与pH值有关值有关 选择流动相选择流动相:应同时考虑极性及应同时考虑极性及pH值值 酸性物质酸性物质加入酸加入酸HAc tR，k 碱性物质碱性物质加入碱加入碱NH3H2O tR，k 调节调节pH范围：范围：3.08.0 pH8.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH3.0 pH3.

19、0 腐蚀柱子腐蚀柱子 3）适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸弱酸;pH=78弱碱弱碱;两性化合物两性化合物 2对流动相的要求对流动相的要求: 1）与固定液不反应）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的最理想的 3）与检测器匹配）与检测器匹配: UV（常用（常用,测定波长应大于溶剂的截止波长）测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学荧光，电化学 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气使用前过滤、脱气 3洗脱方式洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）等度洗脱

20、（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似类似GC的等温度洗脱的等温度洗脱 2）梯度洗脱）梯度洗脱: 在一定分析周期内不断变换流动相的种类在一定分析周期内不断变换流动相的种类 和比例和比例 即不断改变其极性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似GC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品） 3 3离子交换色谱离子交换色谱 原理原理:离子交换树脂上可电离的离子与流动相中离子交换树脂上可电离的离子与流动相中 具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换具有相同电荷的溶质

21、离子进行可逆交换,而离子对而离子对 交换剂具有不同的亲和力而达到分离。交换剂具有不同的亲和力而达到分离。 溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色 谱法分离。谱法分离。 3 3离子交换色谱离子交换色谱 阳离子交换阳离子交换: M （ （Na+-O3S树脂）树脂） （ M+-O3S树脂）树脂）+Na+ 溶剂中溶剂中 阴离子交换阴离子交换: X- （Cl-+R4N树脂）树脂） （ Cl-+R4N树脂）树脂）+Cl- 空间排斥（阻）色谱空间排斥（阻）色谱 固定相为凝胶（固定相为凝胶（gel),通常为交联葡聚糖凝胶。通常为交联葡聚糖凝胶。 原理原理:溶质在两

22、相中按分子大小进行分离。分离溶质在两相中按分子大小进行分离。分离 只与凝胶孔径的分布和溶质的流体力学体积或只与凝胶孔径的分布和溶质的流体力学体积或 分子的大小有关。分子的大小有关。 硅胶型、聚苯乙烯型、葡聚糖凝胶型硅胶型、聚苯乙烯型、葡聚糖凝胶型 空间排斥（阻）色谱空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography 空间排斥（阻）色谱空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 空间排斥（阻）色谱空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 空间排斥（阻）色谱空间排斥

23、（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 空间排斥（阻）色谱空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 空间排斥（阻）色谱空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 特点特点: 1. 样品出峰在溶剂之前样品出峰在溶剂之前,柱内峰扩展较小，半柱内峰扩展较小，半 峰宽窄。峰宽窄。 2. 固定相和流动相选择简单。固定相和流动相选择简单。 3. 相对分子量范围较宽，样品溶解性好即可。相对分子量范围较宽，样品溶解性好即可。 化学键合相色谱化学键合相色谱 B

24、onded Phase Chromatography SiO H+ ROH SiOR + H2O SiO H+ R3SiCl SiOSiR3 + H C l 1 功能基团的引入方法功能基团的引入方法 液-液色谱法及离子对色谱法固定相 液-固吸附色谱法固定相 离子交话色谱法固定相 排阻色谱法固定相 液液-液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法及离子对色谱法固定相 全多孔型担体全多孔型担体 表层多孔型担体表层多孔型担体 担体担体 固定液固定液: 强极性强极性:,- 氧二丙腈氧二丙腈 中等极性中等极性:聚乙二醇聚乙二醇- 400 非极性：角鲨烷非极性：角鲨烷 液液-液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法

25、及离子对色谱法固定相 通过化学键把有机分子结合到担体表面通过化学键把有机分子结合到担体表面 化学键合固定相化学键合固定相 硅氧碳键型: 硅碳键型: 硅氮键型: 硅氧硅碳键型： SiOC SiC SiN SiOSiC 化学键合相色谱化学键合相色谱 Bonded Phase Chromatography Si Si Si O O O O OH OH OH +RSiCl3 Si Si Si O O O O O O O Si R 硅胶表面 硅胶表面 化学键合相色谱化学键合相色谱 Bonded Phase Chromatography R-C4, -C8, -C18 -C6H5, -CN, -NH2 -

26、SO3H, -COOH, -NR4Cl - 特点特点: I.表面没有液坑表面没有液坑,比一般液体固定相传质快比一般液体固定相传质快; II.无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿 命命; III.可以键合不同的官能团，能灵活的改变选择可以键合不同的官能团，能灵活的改变选择 性，应用于多种色谱类型及样品的分析性，应用于多种色谱类型及样品的分析； IV. 有利于梯度洗脱，也有利于配用灵敏的检测有利于梯度洗脱，也有利于配用灵敏的检测 器和馏分的收集；器和馏分的收集； 化学键合相色谱化学键合相色谱 Bonded Phase Chromatography 2正相色谱

27、正相色谱 3 反相色谱反相色谱 RP-HPLCRP-HPLC 4 反相离子对色谱反相离子对色谱 RP-Ion-Pair HPLCRP-Ion-Pair HPLC N SO3H O N SO3H O M2+ N SO3H OH NM(HQS)n2-n 液液-固吸附色谱法固定相固吸附色谱法固定相 吸附剂吸附剂:硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺 担体担体:全多孔型、薄壳型全多孔型、薄壳型 510um的硅胶微粒（全多孔型）的硅胶微粒（全多孔型） 离子交话色谱法固定相离子交话色谱法固定相 按担体分: 薄膜型离子交换树脂 离子交换键合固定相 键合薄壳型 键合微粒型 按官能团分: 阳

28、离子交换树脂 阴离子交换树脂 强酸型阳离子交换树脂 弱酸型阳离子交换树脂 强酸型阴离子交换树脂 弱酸型阴离子交换树脂 排阻色谱法固定相排阻色谱法固定相 1.软质凝胶 2.半硬质凝胶 3.硬质凝胶 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠 流动相为水,只能用于常压 流动相为非极性有机溶剂,能耐较高压，流速不宜大 流动相溶剂,压力，流速、PH或离子强度影响小，适合于较高流速下操作 流动相的纯度 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 样品在流动相中要溶解 溶剂的粘度要小 应与检测器匹配 选择流动相应注意的因素选择流动相应注意的因素: 调节流动相的极性,通过多次

29、试验，以选择到合适 的溶剂。 流动相极性的选择流动相极性的选择: 正相色谱溶剂的选择 底剂:低极性溶剂 洗脱剂:极性较强的针对性溶剂 反相色谱溶剂的选择 底剂:极性溶剂 洗脱剂:不同配比的有机溶剂 离交色谱流动相的选择: 排阻色谱法溶剂的选择 分析介质:水 组分保留值的调节: 调节盐浓度（离子强度） 调节PH 溶剂性质与凝胶相适应 溶剂粘度低 液相色谱仪单元组件液相色谱仪单元组件 基本组件基本组件 高压输液泵高压输液泵 色谱柱色谱柱 检测器检测器 数据系统数据系统 记录仪记录仪 积分仪积分仪 色谱工作站色谱工作站 其余组件其余组件 在线脱气装置在线脱气装置 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 自动进样系

30、统自动进样系统 全自动控制系统全自动控制系统 柱后反应系统柱后反应系统 液相色谱流程图液相色谱流程图 PUMP Detector W Data station (Recorder) or Collection 高效液相色谱仪 流动相前处理流动相前处理 高压泵高压泵 进样装置进样装置 色谱柱色谱柱 检测器检测器 控制与记录系统控制与记录系统 1.流动相的前处理 流动相过滤流动相过滤:0.45或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜 目的目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱 柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液 1.流动相的前处理 减压抽滤脱气法减压抽滤脱气法 低溶性惰性气体导入替换低溶性惰性气体导入替换 超

31、声脱气超声脱气 流动相脱气流动相脱气: 高压输液泵是液相色谱仪的关键高压输液泵是液相色谱仪的关键 部件部件,其作用是将流动相以稳定的流速其作用是将流动相以稳定的流速 或压力输送到色谱系统。对于带在线或压力输送到色谱系统。对于带在线 脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱 气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳 定性直接关系到分析结果的重复性和定性直接关系到分析结果的重复性和 准确性。准确性。 2.高压泵 高压泵的基本要求高压泵的基本要求 流量准确可调。对于一般的分析工作而言,流动相的流速在0.5- 2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-1

32、0mL/min。输液泵的流量 控制精度通常要求小于0.5%。输液泵必须能精确地调节流动相 流量，这可以通过电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流 量的测定通常采用热脉冲流量计。 耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10粒径）的填料， 在高压下填充到柱管中的，为了保证流动相以足够大的流速通过 色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到30- 60MPa的高压。 液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器 泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体 积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料应耐化学腐蚀。 泵分类泵分类 输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵输液

33、泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵 输液泵的流量稳定性非常重要,流速的变化会引起溶质的保留值的变 化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。 输液泵按工作方式分为往复式柱塞泵和气动放大泵两大类输液泵按工作方式分为往复式柱塞泵和气动放大泵两大类 气动放大泵气动放大泵 泵出口压力在系统中是恒定的泵出口压力在系统中是恒定的,流速由柱的阻力决流速由柱的阻力决 定。定。 泵压力由两活塞的面积比决定。操作简便，流量泵压力由两活塞的面积比决定。操作简便，流量 范围大，但流速取决于溶剂粘度和柱渗透性。液缸范围大，但流速取决于溶剂粘度和柱渗透性。液缸 大不便清洗。流量有波动。大不便清洗。

34、流量有波动。 特点特点:高压、无脉动、成本低，用空气压缩机或气高压、无脉动、成本低，用空气压缩机或气 体钢瓶低压驱动，操作成本低。缺点是更换溶剂困体钢瓶低压驱动，操作成本低。缺点是更换溶剂困 难。难。 气动放大泵气动放大泵 往复式高压恒流泵 柱塞泵原理柱塞泵原理 高效液相色谱法高效液相色谱法 HPLC 梯度洗脱（淋洗） 低压梯度 高压梯度 PUMP PUMP PUMP 浓度 时间 梯度洗脱的实质实质是通过不断地变化流动相的强度,来调整混合样品中 各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色 谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度 洗脱中溶质k值的变化是通

35、过流动相的极性、pH值和离子强度来实现 的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。 梯度洗脱形式的选择梯度洗脱形式的选择 梯度洗脱梯度洗脱: v优点优点: 可以提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测可以提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测 量和提高分离度。量和提高分离度。 v 注意事项注意事项: 1. 溶剂纯度要高溶剂纯度要高,否则梯度洗脱重现性差。否则梯度洗脱重现性差。 2.溶剂互溶性要好溶剂互溶性要好 3.选择合适的检测器选择合适的检测器 进样装置进样装置 检测器检测器 紫外光度检测器 荧光检测器 差示折光检测器 电导检测器 蒸发光散射质量检测器 性能/检测器紫外荧光折光安培电导 测量参数

36、吸光度荧光强度折射率电流电导率 类型选择性选择性通用选择性选择性 池体积11032031011 噪声/测量参数单位10-410-310-710-910-3 最小检测浓度/g/mL10-1010-1110-710-12103 线性范围103103104105104 温度影响小小大大大 流速影响无无有有有 可否用于梯度洗脱能能不能不能不能 对样品有无破性无无无无无 检测器的主要性能检测器的主要性能 紫外光度检测器紫外光度检测器 紫外-可见光检测器（UVD）又称紫外检测器。约有80 的样品可以使用这种检测器,是HPLC中应用最广泛的 检测器。它可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检 测器三种类型。固

37、定波长紫外检测器常采用汞灯的 254nm或280nm谱线，许多有机官能团可吸收这些波长。 可变波长紫外检测器实际上是紫外可见分光光度计作检 测器。它既可测紫外区（190350nm)的光吸收变化， 也可向可见光区(350700nm)延伸。 紫外光度检测器紫外光度检测器 紫外检测器由光源、流通池和记录器组成,其工作原理是进入检测 器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度 的关系符合光吸收定律。光学系统如图，由光源产生波长连续可调 的紫外光或可见光，经过透镜和遮光板变成两束平行光，无样品通 过时，参比池和样品池通过的光强度相等，光电管输出相同，无信 号产生;有样品通过时，由于样品对

38、光的吸收，参比池和样品池通 过的光强度不相等，有信号产生。根据朗伯比尔定律，样品浓度 越大，产生的信号越大，紫外检测器灵敏度高，检测下限约为10- 10gmL;而且线性范围广，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗 脱;不破坏样品，可用于制备。紫外检测器缺点是只对具有-或 P-共轭结构的化合物才能检测。流动相的选择有一定限制。 UVD广泛应用源于以下的特点广泛应用源于以下的特点: （1）灵敏度高）灵敏度高;噪声低噪声低,可降至可降至10-4。最小检测浓度达。最小检测浓度达10- 10 g/mL。最小检测量达。最小检测量达10-12 g数量级。线性范围数量级。线性范围 宽，应用广泛。宽，应用广泛。 （

39、2）对流动相基本无响应，属溶质性能检测器。受操作条）对流动相基本无响应，属溶质性能检测器。受操作条 件变化和外界影响很小，一般对流速和温度不太敏感，适件变化和外界影响很小，一般对流速和温度不太敏感，适 用于梯度洗脱。用于梯度洗脱。 （3）属选择性检测器，对无紫外吸收的物质如饱和烃及有）属选择性检测器，对无紫外吸收的物质如饱和烃及有 关衍生物无响应。关衍生物无响应。 （4）需选用无紫外吸收持性的溶剂作流动相。）需选用无紫外吸收持性的溶剂作流动相。 （5）属浓度敏感型检测器。）属浓度敏感型检测器。 （6）属非破坏性检测器，可要用于制备色谱，也能与其它）属非破坏性检测器，可要用于制备色谱，也能与其它

40、 检测器串联使用。检测器串联使用。 （7）结构简单，维修方便。）结构简单，维修方便。 光电二极管阵列吸光度检测器光电二极管阵列吸光度检测器 1982年惠普公司推出世界上首台光电二极管阵 列检测器以来,HPLC获得许多重大发展，一次 进样可得到更多信息，数据处理更快。光电二 极管阵列检测器有1024个二极管阵列，是同时 可以得到吸光度、波长、时间这样三维光 谱-色谱图情报的检测器。能以实际的时间瞬时 测定在所有波长上的吸光度，可得到立体的光 谱-色谱图。为分析工作者提供了十分丰富的定 性定量信息。 光电二极管阵列吸光度检测器(photodiode array detector; PDAD) (1

41、)在药物学和毒物学中的应用 生物体内的毒品药物代谢产物的研究鉴定是个难题,尤其是浓度低及复杂 生物基体组成变化时，识别更困难。药物代谢光谱往往与原药物相似。 用二极管阵列检测器，可以将每个色谱峰的光谱图与原药物光谱图进行 比较来确认原药代谢物色谱峰。 (2) 在生物科学中的应用 肽和蛋白质的制备过程中，必须控制最终产品的纯度。高效液相色谱法 可分离出肽和蛋白质中的杂质。由于肽和蛋白质的光谱差异性很小，用 普通紫外检测器不能检测出肽和蛋白质中的杂质，只有利用极管阵列检 测器提供的高重现性光谱才能准确测定。 (3) 在环境科学中的应用 饮用水中农药污物的标准分析方法是GC-MS联用法。但对不稳定化

42、合 物，HPLC是一种理想方法。利用二极管阵列检测器结合自动谱图检索， 成功分析了饮用水中的苯脲类除草剂、三嗪类农药及甲氨酸脂。有文献 报导在河水检测中，利用固相萃取-液相色谱-二极管阵列检测器建立自 动报警系统:该系统利用聚合物固相萃取装置和二极管阵列检测器，在 5060min内可分析100mL河水中100150种有机微量污物。 光电二极管阵列吸光度检测器光电二极管阵列吸光度检测器 1982年惠普公司推出世界上首台光电二极管阵 列检测器以来,HPLC获得许多重大发展，一次 进样可得到更多信息，数据处理更快。光电二 极管阵列检测器有1024个二极管阵列，是同时 可以得到吸光度、波长、时间这样三

43、维光 谱-色谱图情报的检测器。能以实际的时间瞬时 测定在所有波长上的吸光度，可得到立体的光 谱-色谱图。为分析工作者提供了十分丰富的定 性定量信息。 示差折光检测器（示差折光检测器（differential refractive index detector） 工作原理工作原理 示差折光检测器是通过连续测定色谱柱流出液折光率的变化来 检测样品浓度的。就是检测参比池（流动相本身）和样品池中 流动相之间的折光率差值。差值与浓度呈正比。见图,当参比 池与测量池充满流动相时，它们的折光率相等，此时，光强相 抵消，当测量池有组分时，因折光率与流动相不同，则折光发 生一个距离的偏转，偏转程度与组分的性质、

44、浓度有关。 偏转式差示折光检测器光路图偏转式差示折光检测器光路图 结构结构 示差折光检测器有反射型和折射型。 反射式示差折光检测器原理反射式示差折光检测器原理:光在两种不同物质界面的反射百分 率与入射角和两种物质的折射率成正比。如果入射角固定,光线反 射百分率仅与这两种物质的折射率成正比。光通过仅有流动相的 参比池时，由于流动相组成不变，故其折射率是固定的;光通过工 作池时，由于存在待测组分而使折射率改变，从而引起光强度的 变化，测量光强度的变化，即可测出该组分浓度的变化。 偏转式示差折光检测器原理偏转式示差折光检测器原理:当一束光透过折射率不同的两种物 质时，此光束会发生一定程度的偏转，其偏

45、转程度正比于两物质 折射率之差。 特点特点 （1）凡是具有与流动相折射率不同的组分）凡是具有与流动相折射率不同的组分,均可以使用这种检测器。因此是一均可以使用这种检测器。因此是一 种通用型检测器。它对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃种通用型检测器。它对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃 等都能检测。示差折光检测器还适用于流动相紫外吸收本底大，不适合用紫外检等都能检测。示差折光检测器还适用于流动相紫外吸收本底大，不适合用紫外检 测器的体系。在凝胶色谱中示差折光检测器是必不可少的，尤其是对聚合物，如测器的体系。在凝胶色谱中示差折光检测器是必不可少的，尤其是对聚合物

46、，如 聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布的测定。聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布的测定。 （2）属浓度敏感型检测器。其响应信号与溶质浓度成正比。）属浓度敏感型检测器。其响应信号与溶质浓度成正比。 （3）示差折光检测器属于中等灵敏度检测器，灵敏度不高是差折光检测器的最）示差折光检测器属于中等灵敏度检测器，灵敏度不高是差折光检测器的最 大缺点。最小检测浓度达大缺点。最小检测浓度达10-6 10-7g/mL，不能做痕量分析。线性范围宽小于，不能做痕量分析。线性范围宽小于105。 （4）示差折光检测器对压力和温度变化敏感。折光物质由于压力和温度变化引）示差折光检测器对压力和温度变化敏感。

47、折光物质由于压力和温度变化引 起该物质密度变化，而导至折射率的改变。起该物质密度变化，而导至折射率的改变。 （5）示差折光检测器最常用的溶剂是水，原则上所有透明溶剂都可以使用。流）示差折光检测器最常用的溶剂是水，原则上所有透明溶剂都可以使用。流 动相强度与的折射率无关。选择适合的溶剂，检测器的响应可以加强。示差折光动相强度与的折射率无关。选择适合的溶剂，检测器的响应可以加强。示差折光 检测器最大的优点是其通用性，但这同时也是它的缺点。由于溶剂之间的折射率检测器最大的优点是其通用性，但这同时也是它的缺点。由于溶剂之间的折射率 只相差零点几个折光单位，因此溶剂组成的任何变化对测定都有有明显影响，如

48、只相差零点几个折光单位，因此溶剂组成的任何变化对测定都有有明显影响，如 二元、三元溶剂混合不完全二元、三元溶剂混合不完全;色谱柱漏液色谱柱漏液;溶剂中有气泡等。一般空气饱和溶剂的折溶剂中有气泡等。一般空气饱和溶剂的折 射率较稳定，故常采用空气饱和溶剂作流动相。另外，为避免流通池中气泡的形射率较稳定，故常采用空气饱和溶剂作流动相。另外，为避免流通池中气泡的形 成，还要将检测器的流动相出口位置提高。成，还要将检测器的流动相出口位置提高。 （6）示差折光检测器不能用于梯度洗脱。）示差折光检测器不能用于梯度洗脱。 荧光检测器荧光检测器(fluorescence detector;FD) 荧光检测器适用

49、于本身具有荧光的物质,或将无荧光物质衍 生成荧光体物质的检测。 工作原理工作原理: 物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能 级，这些电子从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光波 长较长的光，这种光称为荧光。在其他条件一定的情况下，荧 光强度与物质的浓度成正比。 许多有机化合物具有天然荧光活性，另外，有些化合物可以 利用柱后反应法或柱前反应法加入荧光化试剂，使其转化为具 有荧光活性的衍生物。在紫外光激发下，荧光活性物质产生荧 光，由光电倍增管转变为电信号。 直角型滤色片荧光检测器光路图直角型滤色片荧光检测器光路图 特点特点 （1）检测器灵敏度非常高）检测器灵敏度非常高,其检出量可

50、达其检出量可达10-13g，荧光检测器灵敏，荧光检测器灵敏 度比紫外检测器高出度比紫外检测器高出23个数量级，适合于痕量分析。蒽是常用个数量级，适合于痕量分析。蒽是常用 的衡量检测器灵敏度的基准物质。的衡量检测器灵敏度的基准物质。 （2）有良好的选择性。荧光检测器的高选择性能够避免不发荧光）有良好的选择性。荧光检测器的高选择性能够避免不发荧光 分子的干扰，这是其独特的优点。它适合于稠环芳烃、甾族化合分子的干扰，这是其独特的优点。它适合于稠环芳烃、甾族化合 物、酶、氨基酸、胺类、维生素、蛋白质等荧光物质的测定。物、酶、氨基酸、胺类、维生素、蛋白质等荧光物质的测定。 （3）线性范围较宽，约）线性范

51、围较宽，约104105。 （4）受外界条件的影响较小。）受外界条件的影响较小。 （5）只要选择作流动相的溶剂不发荧光，荧光检测器就能用于梯）只要选择作流动相的溶剂不发荧光，荧光检测器就能用于梯 度洗脱。度洗脱。 （6）其缺点是应用范围较窄。）其缺点是应用范围较窄。 电导检测器已成为离子色谱最常用的检测器。与安培 检测器不同,电导检测池内没有化学反应发生，电导检测 器是通过测量溶液中离子的电导变化来测定样品浓度的。 电导检测器结构简单、成本低、线性范围宽、死体积小。 原则上离子状态的物质都可以用电导检测器检测。电导 检测器是一种通用型的电化学检测器。 电导检测器电导检测器 蒸发光散射质量检测器蒸

52、发光散射质量检测器(Evaporative Light-Scatting Mass Detector, ELSD) HPLC的发展中受到限制的一个原因, 就是缺少像GC中的FID一样 的灵敏、通用型的检测器。20世纪80年代后研制的蒸发散射质量 检测器给这一领域带来希望,并向具有真正通用型意义的检测器方 向发展。这就是:样品结构不需要具备紫外发色团和合适的折射率; 对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不敏感;对各种物质的响应因 子很接近；在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质。 蒸发光散射质量检测器蒸发光散射质量检测器(Evaporative Light-Scatting Mass Detecto

53、r, ELSD) 原理 在一定的条件下,光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散 射光强度与样品微粒质量的关系为 I = k mb 式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质） 决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。 散射质量检测和电导测定一样，电导是所有离子的通用性质，光 散射是所有粒子的通用性质。对于色谱法来说，溶质已经分离， 关键的问题是如何除去流动相和保证检测条件的一致性。 经色谱柱分离的组分随流 动相进入雾化器雾化器,被高速的 载气流（氦气、氮气或空 气）喷成一种薄雾。这些 雾粒子进入可控制温度的 蒸发器蒸发器（漂移管漂移管）中，使 流动相气化蒸发，溶剂蒸

54、 发后剩下的不挥发组分成 为微小的雾状颗粒，进入 光散射池光散射池进行检测。在光 散射池中溶质被光源照射 而产生光散射，根据散射 光强度正比于溶质粒子数 目及粒子的大小，确定组 分的含量。 蒸发散射质量检测器的工作原理工作原理: （1）雾化池中雾化:经色谱分离的组分随流动相进入与色谱柱出 口直接相连的雾化器针管中,在雾化器末端器流出物与高速气流 （雾化载气流速:2 5 L / min）混合成均匀的气溶胶雾状颗粒。 （2）漂移管中蒸发：这些气溶胶雾状颗粒进入可以控制温度（蒸 发器温度：100 180 ）的蒸发漂移管中，使流动相汽化蒸发， 只剩下挥发性较小的被测物质雾状颗粒，它们高速通过蒸发漂移

55、管进入光散射池。 （3）光电检测器中检测：在光散射池中，光源光线通过光散射池 中的被测物质雾状颗粒，然后被光阱捕集，以防止反射。样品颗 粒散射光源发出的光用光电检测器接收，转换成电信号。蒸气状 态溶剂通过光路时，光线反射到检测器上成为稳定的基线信号。 雾状溶质颗粒通过光路时，被检测器收集。测量得的信号与在光 散射池中样品的量成正比。 结构结构 (l)通用性强,灵敏度高于示差折光检测器。灵敏度低于荧光、紫外检测器。 (2)对流动相系统温度变化不敏感。可进行梯度洗脱。 (3)响应因子具有一致性。蒸发散射质量检测器的响应值仅取决于光束中溶质 颗粒的大小和数量，检测器对的有物质几乎具有相同的响应因子。

56、因此无需测 定定量校正因子。 (4)可消除流动相和杂质的干扰，提高了分辩率。与光吸收检测器相比，能解 决最困难的HPLC检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收 或紫外吸收系数很小的化合物的检测。 (5)便于应用于质谱分析。因为蒸发散射质量检测器与质谱条件的要求是一致 的。 (6) 蒸发散射质量检测器受样品组分和流动相挥发性因素限制。要求样品组分 应是非挥发性或半挥发性的，而流动相应是挥发性溶剂。 (7) 对某些样品，蒸发散射质量检测器线性范围窄，有时不呈现线性关系，定 量分析较为复杂。 蒸发散射质量检测器的优缺点蒸发散射质量检测器的优缺点 色谱数据处理系统色谱数据处理系统 峰的检测 峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上,预设 一个“阈值”，超过该值时，判别