耐高温乳酸菌的分离与鉴定

1、learning must be like a bee, plucking many flowers in order to produce honey.勤学乐施积极进取（页眉可删）耐高温乳酸菌的分离与鉴定 耐高温乳酸菌的分离与鉴定【1】【摘要】 目的：本实验从不同地方采集的青贮玉米饲料、果渣、牛奶、新鲜的泡菜汁等样品中筛选耐高温乳酸菌。方法：通过初筛、复筛，获得一株耐高温且产酸能力较强的菌株l1;依据伯杰氏系统细菌学手册和乳酸菌分类鉴定的标准和描述，对其进行了生理生化特性鉴定;通过单因素试验和正交试验确定菌株l1的最佳发酵条件。结果：确定其为乳杆菌属德氏乳杆菌;最佳增殖培养基组分为：玉米粉1

2、6%+麸皮5%;在-淀粉酶(5 u/g玉米粉、90 、30 min)和糖化酶(150 u/g玉米粉、55 、2 h3 h)酶解作用下，最佳发酵条件为：发酵温度60 ，发酵时间36 h，ph值3.5。结论：经过初筛、复筛获得一株耐高温菌株l1，通过糖发酵等生理生化试验、正交试验鉴定，最后确定此菌株为乳杆菌属德氏乳杆菌(lacotobacillus delbbruecki)。【关键词】 耐高温乳酸菌;分离;鉴定乳酸菌(lactobacillus)是一类能从可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)产生大量乳酸的细菌的统称1。由于乳酸菌具有糖利用率高、发酵液中纯度高、副产物少，使其在乳酸工业中占有重要地位2。

3、乳酸菌在食品发酵、青贮饲料、堆肥生产、医药行业等众多领域有着广泛的应用研究3，4，而在众多固态发酵领域中一个难以解决的问题是固态发酵中高温迅速产生对乳酸菌的杀灭作用，因而选育耐高温菌株具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景。本研究从青贮饲料、果渣、泡菜、牛奶中分离高温乳酸菌，并对其发酵条件的优化进行了初步研究。1 材料与方法1.1 实验材料乳酸菌：从上海光明乳业金山牧场提供的青贮玉米饲料、陕西海盛果汁厂提供的果渣、山东牟平安得利果汁厂提供的果渣、西安农贸市场购得的新鲜泡菜汁、上海光明乳业提供的牛奶中进行分离，将收集的样品带回实验室置于4 冰箱保存备用。标准菌株：德氏乳杆菌(lactobacil

4、lus delbbruecki) jcm 1022、嗜酸乳杆菌(lacidophilus) atcc 3456、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)ifo 13957,由陕西微生物研究所提供。培养基: 玉米粉麸皮发酵培养基、生化鉴定培养基。1.2 实验方法1.2.1 乳酸菌的分离、筛选： 固体样品青贮玉米饲料、果渣等5 g放入灭菌研钵研碎后移入其他灭菌容器内，加500 ml无菌生理盐水稀释，振荡5 min，充分混匀;液体样品牛乳取1 ml移入9 ml的灭菌生理盐水的试管中，摇匀;对新鲜的泡菜汁取1 ml移入9 ml无菌水中，摇匀;然后将上述样品按照 10倍稀释法稀

5、释至10-5、10-6、10-7，用移液枪分别移取0.1 ml到0.5% caco3的mrs培养基并加焦性没食子酸的厌氧培养基上，37 培养24 h48 h，形成菌落后观察其形态，挑取周围有溶钙圈的菌落。在mrs平板上反复划线直到得到单菌落;将上述分离的乳酸菌进行革兰氏染色形态观察，淘汰革兰氏染色阴性的菌株，保留革兰氏染色阳性的菌株;同时做接触酶试验，最后保留接触酶试验阴性的菌株。综上结果，将菌落周围有溶钙圈、革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性的菌株暂定为乳酸菌，最后将其分别转移至mrs斜面培养基上，做好标记，于4 条件下保藏。1.2.2 乳酸菌复筛：(1)最适生长温度的测定：将待测菌株活化后分别

6、置于温度为50 、55 、60 、65 、70 的恒温箱中培养，培养24 h后测其总菌数。(2)最适酸碱度的测定：将上述耐温能力强且菌数量较多的菌株放在适中的温度下培养，测其在不同培养时间培养液ph值的变化情况。1.2.3 耐高温乳酸菌的鉴定： 用光学显微镜进行乳酸菌的形态学鉴定; 参照伯杰氏细菌鉴定手册及乳酸细菌分类鉴定及实验方法进行生理生化特性鉴定4。2 结果2.1 分离到的菌株从不同地区采集的样品中共分离到有溶钙圈较大的、革兰氏阳性的、接触酶试验阴性的菌株共6株，显微镜下观察菌体形态，其中球菌3株，杆菌3株，分别对其进行编号，球菌记为r，杆菌为l。2.2 优良菌株筛选结果2.2.1 耐温

7、能力筛选：6株菌的耐温能力见表1。由表1得出：在各温度条件下，菌株l1、l2、r1的菌数量均多于菌株l3、r2、r3的菌数量，所以选择菌株l1、l2、r1作下一步的试验。表1 菌株培养温度与菌数的关系2.2.2 产酸能力筛选：将菌株l1、l2、r1在60 恒温箱中培养，测其在不同培养时间培养液ph的变化情况，培养结果见表2。通过表2可见，三株菌的产酸能力，l1菌株在20 h时，其ph值就下降到4.1，而其它两株菌产酸则较慢。表2 菌株培养时间与ph值的关系2.3 乳酸菌鉴定2.3.1 形态学鉴定：菌株l1的革兰氏染色阳性，中长杆状、单个或链状;菌落形态呈灰白色、圆形、边缘完整、表面光滑、隆起。

8、 见图1。2.3.2 生理生化及糖发酵试验： 菌株l1的硝酸盐还原、h2s试验、明胶水解、吲哚反应、接触酶试验及石蕊牛奶试验结果:除石蕊牛奶试验阳性外，其它反应均为阴性。菌株l1对碳水化合物的利用情况:l1 菌株能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、可溶性淀粉产酸，不能利用半乳糖、乳糖、葡萄糖酸钠、阿拉伯糖、棉籽糖、山梨醇、木糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、肌醇、鼠李糖产酸。根据以上鉴定结果，参照伯杰细菌鉴定手册及乳酸细菌分类鉴定及实验方法,菌株l1属于乳杆菌属德氏乳杆菌(lacotobacillus delbbruecki)。结果见表3。表3 菌株l1碳源利用情况 注：表中“+”表示95%以上为阳性

9、，“-”表示95%以上为阴性, “-w”弱阴性反应,“d”未测定。3 讨论本实验经过初筛及复筛，证明l1菌株具有耐高温且产酸量高的特点。对l1菌株进行了常规鉴定，确定其归属为乳杆菌属德氏乳杆菌，对于其细胞壁的组成以及细菌中细胞dna中g+c含量的摩尔分数的测定，有待进一步研究。乳酸菌因可以提高食品的营养价值，近年来乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。研究表明6：乳酸菌能调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能;提高食物消化率和生物效价;降低血清胆固醇，控制内毒素;提高机体免疫力;抑制肠道内菌生长和产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理

10、功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。可以说，如果乳酸菌停止生长，人和动物就很难健康生存。也正因为如此，乳酸菌不仅应用于食品工业中，而且在工业、农业、医药卫生等领域也有着十分广泛的用途7。在众多发酵领域中一个难以解决的问题是发酵中高温迅速产生对乳酸菌的杀灭作用，因此耐高温乳酸菌的成功选育对于解决发酵的难题具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景，有待于进一步开发推广。【参考文献】1 杨郁，张丽靖，天知诚吾.耐酸性乳酸菌的筛选及应用的初步研究j.浙江农业科学，20_，46(4)：463.2 g

11、olueke c g,lafrenz d,chaser b,diaz l f.composting combined refuse and sewage sludge. compost sci./land utiliz.,1980,21(5):4248.3 席北斗，刘鸿亮，白庆中，等.堆肥中纤维素和木质素的生物降解研究现状.环境污染治理技术与设备,，3(3)：1923.4 凌代文，东秀珠.乳酸菌分类鉴定及试验方法m.中国轻工业出版社，1999：3198.5 闫波，刘宁.乳酸菌及其在食品工业中的应用与展望j.食品开发与研究，25(4)：2223.乳酸菌的应用与发展前景【2】摘要 通过对乳酸菌的研

12、究,了解到只有经过特殊工艺处理的乳酸菌才能到达肠道。进入肠内的乳酸菌,必须具备数量多、活力强的特性,才能发挥其生物功效。如何研制出高浓度且活力强的乳酸菌,是当今微生物学家追求的方向。关键词 乳酸菌;乳酸菌制品;应用发展目前,乳酸菌及乳酸菌饮料在中国市场可谓家喻户晓,它正以每年25%的速度在增长,据有关报道,中国的乳酸菌奶饮品的年总产量已经突破50万吨,年产值也超过25亿元人民币。在国外益生菌产品的发展也普遍受到重视,像日本市场上各种品牌的益生菌产品满目皆是,非常吸引消费者的注意力。1 乳酸菌分类乳酸菌大体上可分为两大类。一类是动物源乳酸菌,一类是植物源乳酸菌。因为动物源取自动物,因此菌种常处于

13、相对不稳定状态,其生物功效也较不稳定,且在大量食用时,很容易导致人体动物蛋白过敏,即排斥反应。而植物源乳酸菌,因为取自植物易被人体认可,不论摄取多大量,都不会产生蛋白排斥反应,且植物源乳酸菌比动物源性更具有活力,能比动物源性蛋白以多8倍的数量到达人体小肠内定植,从而发挥其强大而稳定的生物功效1。2 乳酸菌的治疗和保健乳酸菌对人和动物都有保健和治疗功效,国内、外均有大量动物和临床试验证明,乳酸菌能维持微生态平衡和肠管机能,改善肝功能,防治乳糖不耐症(喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状),还有防癌、抗癌和抗衰老作用。3 乳酸菌的历史及现状20世纪,俄国的生物学家梅契尼柯夫(mechnikoff,184

14、5-1916),在他的“长寿学说”里明确指出,保加利亚的巴尔干岛地区居民,日常生活中经常饮用的酸奶中含有大量的乳酸菌,这些乳酸菌能够定植在人体内,有效地抑制有害菌的生长,减少由于肠道内有害菌产生的毒素对整个机体的毒害,这是保加利亚地区居民长寿的重要原因。 这个“长寿学说”具有划时代意义。今天,乳酸菌及其饮品已在许多国家相当普及2。早在5 000年前人类就已经在使用乳酸菌。人们在认识乳酸菌之前就已利用它们来加工和保存食品,帮助调节肠道微生态平衡,促进排出毒素,促进营养有效吸收。乳酸菌不仅可以提高食品保藏性和附加值,而且有其特定生理活性和保健功能。4 乳酸菌的发展前景有专家报道人体肠道内乳酸菌拥有

15、的数量,随着人的年龄增长会逐渐减少,不健康的饮食习惯、摄入低纤维的食物、每天的压力都会对肠胃健康造成不良的影响。通过乳酸菌清除肠道垃圾能使人们的生活更加健康。当前,由于抗生素的大量使用,使人体肠道内以乳酸菌为主的正常菌群已遭到严重的破坏,人的抵抗力越来越低,人类的健康正面临严重的危胁。人们正在不断寻求新的更加有效的抗菌产品,世界上发达国家已经认识到并开始了以使用乳酸菌为代表的免疫疗法革命。其实普通的乳酸菌,活力极弱,它们只能在相对受限制的环境中存活,一旦脱离开这些环境,其自身也会遭到灭亡。只有经过特殊工艺处理的乳酸菌才能到达肠道。进入肠道内的乳酸菌,必须具备数量多、活力强的特性,才能发挥其生物

16、功效3。如何研制出高浓度且活力强的乳酸菌,成为了当今微生物学家们追求的梦想。据中国食品科学技术学会数据统计显示,20世纪初乳酸菌奶饮料行业在我国乳制品行业的市场份额不足0.1%,到年就超过了3.0%。然而一些发达国家的乳酸菌奶类产品,已占到乳品市场的80.0%,世界乳酸菌奶饮品平均市场占有率已达30.0%。以乳酸菌饮料为代表的乳酸菌应用产业开始走红,已成为业内外的投资热点。要有高质量的产品,必须健全产品的质量,便于生产,也便于管理。医药保健品质量标准已经引起国家有关部门的关注。标准不健全很难与国际接轨。要使乳酸菌及其产业在中国稳健地发展,并给消费者带来真正的健康,就要有规范的东西,那就是标准。

17、老百姓知道如何消费,企业知道如何生产,也便于政府管理。这样,乳酸菌制品及乳酸菌的产业在中国将越走越远,发展会越来越健康。参考文献1黄君红,彭丽珍,王爱兰.酸奶中乳酸菌含量的检测j.中国微生态学杂志, ,13(6):18-19.2徐筠.话说酸奶j.健康,(4):34.3霍贵成.乳酸菌的研究与应用m.北京:中国轻工业出版社,20_:163.贵州少数民族酸肉、酸鱼中乳酸菌的分离鉴定【3】摘要：采用传统微生物分离方法进行乳酸菌纯种分离，利用16s rrna序列分析方法进行乳酸菌鉴定，从7个酸肉、酸鱼样品中共分离出14株乳酸菌，有乳杆菌属、环丝菌属、乳球菌属3个属，9个种。从其中鉴定出7株乳酸菌，分别是

18、：植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、消化乳杆菌(lactobacillus alimentarius)、清酒乳杆菌(lactobacillus sakei)、泡菜乳杆菌(lactobacillus kimchi)、清酒乳杆菌亚种(肉)(lactobacillus sakei subsp. carnosus)、草乳杆菌(lactobacillus graminis)、弯曲乳杆菌(lactobacillus curvatus)。关键词：酸鱼;酸肉;乳酸菌;分离鉴定贵州黔东南苗族、侗族自治州传统发酵酸肉/鱼制品主要是以猪肉和鱼肉为原料，洗净后加入一定量的盐腌制23d，再根

19、据当地的饮食习惯多加甜酒、熟糯米、生姜、花椒、辣椒粉、大蒜等辅料，装入坛、瓦缸、木桶等容器中，上层用叶片、塑料和水来隔绝空气，放置于避光阴凉地方自然发酵。此方法是当地居民延续祖先智慧结晶一代一代传承下来的，具有历史悠久、风味独特、安全和绿色的特点。但由于传统手工工艺制作，发酵时间长，没有大规模的生产和市场上流通，其他地域的人们无法享受这种风味独特的发酵肉制品1-3。乳酸菌是发酵肉制品中的优势菌群，对发酵产品的风味和营养品质变化起着至关重要的作用4-7。目前，对于贵州传统少数民族发酵肉制品中乳酸菌的研究还相当缺乏8。因此，本研究以贵州少数民族地区侗族发酵酸肉和苗族发酵酸鱼为材料，采用传统微生物分

20、离方法进行乳酸菌纯种分离，利用16s rrna序列分析方法进行乳酸菌鉴定9-12，旨在从原生态食品中发掘有益乳酸菌，以利于进一步研究乳酸菌的发酵特性、改进传统工艺，为保护、利用本土原生态的微生物资源打下基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 实验材料实验原料来自于贵州省黔东南州从江县及黎平县农户家纯手工制作的酸肉、酸鱼，共7个样品，其中酸肉4个样品，酸鱼3个样品，采样时严格按照国标gb/t4789.120_食品安全国家标准：食品微生物学检验操作。 酸肉、酸鱼样品分别编号如表1所示。1.1.2 培养基及主要试剂培养基：mrs肉汤培养基、py培养基、pyg液体培养基(在py培养基中添加1

21、0g/l葡萄糖)。主要试剂：革兰氏染色试剂、细菌微量生化鉴定管(麦芽糖、乳糖、葡萄糖)、试剂a(-萘酚5g和95%体积分数乙醇100ml)、试剂b(koh 80g、肌酸(creatine)0.6g、蒸馏水200ml)、溶菌酶、ctab(十六烷基三甲溴化胺)裂解液、tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、聚乙二醇均为分析纯。1.2 仪器与设备cx21sf1奥林巴斯生物显微镜 奥林巴斯(中国)有限公司;s1000tm thermal cycler pcr仪、dcodetm universal mutation detection system dgge电泳仪、gel docxr凝胶成像仪 美国bio-ra

22、d公司;gilson p型移液器 法国吉尔森公司;micro 17r微量高速冷冻离心机 美国thermo electron公司。1.3 方法1.3.1 菌株分离纯化取3g样品，剪碎放入mrs液体培养基中， 36恒温厌氧培养48h，然后稀释5个梯度(10-110-5)后，直接涂布于mrs固体培养基上，36恒温厌氧培养48h。再采用平板划线法对涂布平板中不同的单个菌落进行接种、培养，并进行革兰氏染色和镜检，重复分离纯化直至镜检结果一致。1.3.2 菌株分类鉴定方法 菌落特征对纯化菌株在mrs固体培养基上的菌落特征进行观察、记录和编号，主要包括菌落大小、形状、颜色、湿润度、光泽度、透明

23、度、隆起形状、边缘特征等。将初步认定为乳酸菌菌株进行革兰氏染色镜检。 菌种分类生理生化试验主要生理生化试验包括：接触酶试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇(voges-proskauer，vp)试验、石蕊牛奶试验、淀粉水解试验、葡萄糖产酸试验和糖发酵试验13-15。1.3.3 菌株dna的提取参照谭映月等16提取dna方法，有所改动。取备用菌株菌液2ml于2ml离心管中，8000g离心8min，收集沉淀;加200l溶菌酶(质量浓度为0.05g/ml)，置于35水浴2h;加2%十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，ctab)裂解液

24、0.5ml，上下颠倒混匀10min;加0.5ml tris-饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，上下颠倒混匀2min后，于10000g离心5min;收集上清液转入新的离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇=24：1。上下颠倒混匀2min后于10000g离心5min;收集上清液转入新的离心管，加入2倍体积30%聚乙二醇于4条件下沉淀4h;取出离心管于14000g离心8min，倒掉上清液，用70%体积分数乙醇洗涤dna 3次，经真空干燥后转入0.2ml pcr管，加50ml te(10mmol/l tris-hcl，1mmol/l edta，ph8.0)缓冲液于20保存。耐高温乳酸菌的分离与鉴定【1】

25、【摘要】 目的：本实验从不同地方采集的青贮玉米饲料、果渣、牛奶、新鲜的泡菜汁等样品中筛选耐高温乳酸菌。方法：通过初筛、复筛，获得一株耐高温且产酸能力较强的菌株l1;依据伯杰氏系统细菌学手册和乳酸菌分类鉴定的标准和描述，对其进行了生理生化特性鉴定;通过单因素试验和正交试验确定菌株l1的最佳发酵条件。结果：确定其为乳杆菌属德氏乳杆菌;最佳增殖培养基组分为：玉米粉16%+麸皮5%;在-淀粉酶(5 u/g玉米粉、90 、30 min)和糖化酶(150 u/g玉米粉、55 、2 h3 h)酶解作用下，最佳发酵条件为：发酵温度60 ，发酵时间36 h，ph值3.5。结论：经过初筛、复筛获得一株耐高温菌株l

26、1，通过糖发酵等生理生化试验、正交试验鉴定，最后确定此菌株为乳杆菌属德氏乳杆菌(lacotobacillus delbbruecki)。【关键词】 耐高温乳酸菌;分离;鉴定乳酸菌(lactobacillus)是一类能从可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)产生大量乳酸的细菌的统称1。由于乳酸菌具有糖利用率高、发酵液中纯度高、副产物少，使其在乳酸工业中占有重要地位2。乳酸菌在食品发酵、青贮饲料、堆肥生产、医药行业等众多领域有着广泛的应用研究3，4，而在众多固态发酵领域中一个难以解决的问题是固态发酵中高温迅速产生对乳酸菌的杀灭作用，因而选育耐高温菌株具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景。本研究从青贮饲

27、料、果渣、泡菜、牛奶中分离高温乳酸菌，并对其发酵条件的优化进行了初步研究。1 材料与方法1.1 实验材料乳酸菌：从上海光明乳业金山牧场提供的青贮玉米饲料、陕西海盛果汁厂提供的果渣、山东牟平安得利果汁厂提供的果渣、西安农贸市场购得的新鲜泡菜汁、上海光明乳业提供的牛奶中进行分离，将收集的样品带回实验室置于4 冰箱保存备用。标准菌株：德氏乳杆菌(lactobacillus delbbruecki) jcm 1022、嗜酸乳杆菌(lacidophilus) atcc 3456、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)ifo 13957,由陕西微生物研究所提供。培养基: 玉米粉麸皮发酵培养基、生化鉴定培养基。1.2 实验方法1.2.1 乳酸菌的分离、筛选： 固体样品青贮玉米饲料、果渣等5 g放入灭菌研钵研碎后移入其他灭菌容器内，加500 ml无菌生理盐水稀释，振荡5 min，充分混匀;液体样品牛乳取1 ml移入9 ml的灭菌生理盐水的试管中，摇匀;对新鲜的泡菜汁取1 ml移入9 ml无菌水中，摇匀;