细胞沉默调节蛋白1SIRT1活性比色法定量检测试剂盒中文.doc

1、细胞沉默调节蛋白 1 (SIRT1 )活性比色法定量检测试剂盒(中文版)主要用途细胞沉默调节蛋白1(SIRT1)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过比色探针对硝基苯胺标记人工合成的乙酰化 p53 多肽底物，经过 SIRT1 脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放黄色对硝基苯胺， 即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实 验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品 (动物、人体) 、核蛋白样品、 部分或完全纯化酶样品中 SIRT1 的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景人体组蛋白脱乙酰基

2、酶(histone deacetylase； HDAC )家属分成三类共20多个蛋白：种类I(class I)与酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8,存在于细胞核中；种类II(class II)与酵母Hda1蛋白同源，包括 HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化 结构域含有锌，且曲古菌素A ( trichostatin A ； TSA)敏感。种类III (class III )为NAD +辅助因子必需，又称为 sirtuins，与酵母 Sir2( Silent Information Regulator 2

3、)同源，包括 SIRT1 至7等，为曲古菌素 A( trichostatin A ； TSA)不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶(lysyl-deacetylase)。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由NAD +和乙酰(acetyl)基团转化产生的烟酰胺(nicotinamide )和O-乙酰ADP核糖(O-acetyl-ADP-ribose )。SIRT1位于细胞核内，与酵母Sir2同源性最高。其功能在于调节p53活性和抑制细胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53 ( 379 至382氨基酸位点)多肽底物 Ac-Arg-His-Lys-Lys ( Ac )具有抗氨基肽酶切离的功能，首先使用比色染料对 硝基苯胺

4、(p-Nitroaniline ； p-NA )来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，最后底物进一步在氨基 肽酶的催化酶解，释放出具有强烈吸光值的黄色对硝基苯胺(波长 405nm) ，由此来定量测定沉默调节蛋 白 1 的活性。其反应系统为：Sirt1Ac-Arg-His-Lys-Lys (Ac) -p-NA + NAD 宀 Ac-Arg-His-Lys-Lys- p-NA + nicotinamide + O-acetyl-ADP-ribose氨基肽酶Ac-Arg-His-Lys-Lys- p-NAAc-Arg-His-Lys-Lys + p-NA产品内容裂解液( Reagent A)

5、 分离液( Reagent B) 清理液( Reagent C) 萃取液( Reagent D) 缓冲液( Reagent E) 底物液( Reagent F) 终止液( Reagent G) 酶解液( Reagent H) 补充液( Reagent I) 产品说明书20 毫升80 毫升80 毫升5 毫升3 毫升100 微升200微升200微升500微升1份保存方式保存 缓冲液(Reagent E)、底物液(Reagent F)、终止液(Reagent G)和 酶解液(Reagent H)在20 C冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4 C冰箱里；底物液(Reagent D)避免光照，有效保证

6、6月用户自备磷酸盐缓冲溶液(PBS):用于清洗细胞样品15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器1.5 毫升离心管：用于样品操作和保存的容器(微型)台式离心机：用于细胞预处理培养箱：用于反应物孵育96 孔板或 100 微升厘米光径比色皿：用于反应和比色的容器酶标仪或分光光度仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将-20 C冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备I. 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 107细胞)2 小心抽去培养液3. 小心加入 10 毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液(PBS) ，覆盖生长表面4. 小心抽去清理液5. 使用细胞

7、刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意： 避免使用胰酶消化 )6. 加入1毫升 裂解液(Reagent A),混匀细胞7. 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管8. 强力涡旋震荡 10秒9. 置于冰槽里孵育 15 分钟10. 加入4毫升预冷的 分离液(Reagent B),混匀II. 放进4C台式离心机离心10分钟，速度为1300g12. 小心抽去上清液13. 加入 4 毫升预冷的 清理液( Reagent C)14. 放进4C台式离心机离心10分钟，速度为1300g15. 小心抽去上清液16. 小心加入100微升预冷的 萃取液(Reagent D)，混匀17. 转移到新的预冷的 1.5毫升离心管18. 超声

8、处理 30 秒19. 置于冰槽里孵育 30 分钟20. 放进4C微型台式离心机离心 10分钟，速度为 16000g (或13000RPM，例如EPPENDORF 5415)21. 小心移取上清液到新的预冷的1.5毫升离心管22. 移取 10微升进行蛋白定量检测(注意： 建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 HL 30030.1 )23. 即刻放进70 C保存或置于冰槽里继续后续操作测定准备1 准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等） ，置于冰槽里2. 设定好酶标仪或分光光度仪（温度为 30C）:波长405nm，并置零3 缓冲液（ Reagent E） 置于室温下均衡温度三、活性测

9、定（一） 终点法活性测定1. 在 96 孔板上做好相应标记：背景空对照和待测样品2. 分别移取 55 微升 缓冲液（ Reagent E） 到相应孔里3. 分别加入 5 微升 底物液（ Reagent F）4. 分别加入20微升 补充液（Reagent I）或待测样品（50微克核蛋白或200微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意： 样品须清澈 ）5. 轻轻摇动 96 孔板 30 秒6. 放进30C培养箱里，孵育 60分钟，避免光照7. 分别加入 10 微升 终止液（ Reagent G）8. 分别加入 10 微升 酶解液（ Reagent H）9. 轻轻摇动 96 孔板 30 秒10 .在30 C培

10、养箱里，孵育 30分钟11 .即刻放进酶标仪或转移到 100 微升 1 厘米光径比色皿，在分光光度仪里检测：获得吸光读数12.活性计算：（ 1）酶标仪检测（样品读数背景读数）X样品稀释倍数X 0.10 （体系容量；毫升）-0.02 （样品容量；毫升）X 10.5 （毫 摩尔吸光系数）X 1 （反应时间；小时）X 0.6 （光径距离；厘米）=单位/毫升-（样品蛋白浓度）毫克/ 毫升=单位/毫克单位=微摩尔对硝基苯酚/小时（ 2）比色皿检测（样品读数背景读数） X 样品稀释倍数 X 0.10（体系容量；毫升） -0.020（样品容量；毫升） X 10.5 （毫摩尔吸光系数）X 1 （反应时间；小时

11、）=单位/毫升-（样品蛋白浓度）毫克/毫升=单位/毫克单位=微摩尔对硝基苯酚/小时二） 酶动法活性测定1. 在96孔板上做好相应标记：背景空对照和待测样品2.分别移取 65 微升 缓冲液（ Reagent E） 到相应孔里3.分别加入 5 微升 底物液（ Reagent F）4.分别加入20微升 补充液（Reagent 1）或待测样品（50微克核蛋白或200微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意： 样品须清澈 ）5.轻轻摇动 96 孔板 30 秒6.放进30 C培养箱里，孵育 2分钟，避免光照7.分别加入 10 微升 酶解液（ Reagent H）8.轻轻摇动 96 孔板 5 秒9.即刻放进酶标仪或

12、转移到 100微升 1 厘米光径比色皿，在分光光度仪里检测：间隔5 分钟，读数 6次（共 30 分钟） 获得吸光读数10.活性计算：1） 酶标仪检测（样品读数背景读数）X样品稀释倍数X 0.10（体系容量；毫升）-0.02 （样品容量；毫升）X 10.5 （毫 摩尔吸光系数）X 30 （反应时间；分钟）X 0.6 （光径距离；厘米）=单位/毫升-（样品蛋白浓度）毫克/ 毫升=单位/毫克单位=微摩尔对硝基苯酚/分钟（ 2）比色皿检测（样品读数背景读数） X 样品稀释倍数 X 0.10（体系容量；毫升） -0.020（样品容量；毫升） X 10.5 （毫摩尔吸光系数）X 30 （反应时间；分钟）=

13、单位/毫升-（样品蛋白浓度）毫克/毫升=单位/毫克单位=微摩尔对硝基苯酚/分钟注意事项1 本产品为 20 次操作，包括背景对照2 操作时，须戴手套3 系统操作过程中，背景测定只需 1 次4 样品须澄清，至关重要5.样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF、烷基胺（alkyl amine ）等6 孵育反应完成后即刻进行比色测定7. 滤波器可以使用波长 400nm 替代 405nm8. 测定值由低到高变化；酶动法测定可以持续 60 分钟9. 测定值吸光读数越高，表明酶活性越高10. 比色测定后，比色皿须清洗彻底11. 待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为 50微克/20微升；待测样本为细胞裂解悬液