亲水作用色谱―四极杆静电场轨道阱高分辨率质谱快速测定水样中氨基脲

1、亲水作用色谱四极杆静电场轨道阱高分辨率质谱快速测定水样中氨基脲摘要建立了亲水作用色谱四极杆 / 静电场轨道阱高分 辨质谱快速检测水中氨基脲的方法。水样中加入0.1 mol/LNaOH溶液后，以乙腈为提取剂，加入过量Na2SO4,使乙腈与水分层，乙腈提取液再经无水Na2SO4脱水后，采用亲水作用色谱柱 Amide 色谱柱分离，以 0.1%甲酸水溶液及 0.1% 甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱， 四极杆 /静电场轨道阱 高分辨率质谱电喷雾正离子、选择离子监测模式检测，同位 素内标法进行定量分析。 在最优实验条件下，氨基脲在0.2 20卩g/L浓度范围内线性相关系数为0.997，方法的检出限为0.

2、09卩g/L ,定量限为0.30卩g/L。以淡水和海水为空白 样品，在添加浓度为 0.5,1.0和5.0卩g/kg水平下，氨基脲的加标回收率为 82.3%92.0% ，相对标准偏差小于 7.6% 本方法适用于环境水样中氨基脲的快速分析。关键词 亲水作用色谱； 高分辨质谱； 水样； 氨基脲1 引言氨基脲(Semicarbazide, SEM)属于联胺类化合物中的 一种，它是一种重要的工业原料，可用于制备热敏记录纸上 的光色染料，也用于医药、农药等有机合成的中间体 1。研究表明， 它不仅具有致诱变性和潜在的致癌性，而且还可 对神经系统、内分泌系统的功能产生影响2， 3。在日常生产活动中多种因素容易

3、导致 SEM的产生，如某些含 SEM工 业废水的排放，食品添加剂偶氮甲酰胺在高温加工条件下分 解产生 SEM4， 5，消毒水处理食物产生 SEM6， 7，水产养 殖业中非法使用呋喃西林药物在动物体内也可代谢成为SEM8, 9。由于SEM为水溶性物质，各种途径产生的 SEM 最终随着环境进入水体，SEM已逐渐成为环境中一种全新的 环境污染物10。目前，检测SEM的主要方法有胶体金免疫 层析法 1 1 、酶联免疫分析法 1 2 、高效液相色谱 /串联质谱 法8， 13， 14等。胶体金免疫层析法和酶联免疫法通常用于 样品的快速筛选，方法易受样品基质中类似物质干扰而产生 假阳性；最为常用的分析方法为

4、高效液相色谱/串联质谱法，检测的样品基质包括动物组织、婴幼儿食品、甲壳类水产品 等。由于SEM分子小、极性强，难以直接进行分析，因此目 前所报道的方法通常是先将样品经过2 硝基苯甲醛长时间衍生、衍生液经有机溶剂提取、固相萃取柱净化后，再通过反 相液相色谱柱分离 SEM衍生物，最后以电喷雾质谱进行检测。 该方法灵敏度高，能对样品进行确证检测，但也存在样品前 处理十分繁琐、耗时长的缺点。由于SEM极性很强，在常规的反相色谱柱上没有保留，质谱检测时受基质背景干扰严重， 因此难以采用液相色谱电喷雾质谱方法直接对SEM进行检测。亲水作用色谱技术 15， 16是近年来发展起来的新的分 离手段，可以保留一些

5、用反相色谱无法简单保留的碱性化合 物，因此可以在不衍生的条件下实现对强极性分子SEM 与其它物质的分离。 四极杆 / 静电场轨道阱是一种高分辨质谱技术， 能够提供化合物精确分子质量测定， 实现化合物的快速定 性与定量分析 17 ，非常适于复杂基质中化合物的快速分析， 已广泛应用于蛋白质组学、代谢组学和食品安全领域中小分 子和大分子的快速测定1820。采用亲水作用色谱高分辨 质谱技术直接对 SEM 进行测定尚未见报道。 本研究通过采用 亲水作用色谱技术， 并结合四极杆 /静电场轨道阱高分辨率质 谱技术，建立了一种环境水样中 SEM的灵敏检测方法，适用 于环境水样中痕量 SEM 污染物的快速分析。

6、2 实验部分2.1 仪器与试剂QExactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国 Thermo Fisher 公司）， Dionex UltiMate 3000 液相色谱（美国 Thermo Fisher 公司）；XBrige Amide 液相色谱柱（150 mm x2.1 mm , 3.5 卩 m，美国 Waters 公司）。氨基脲盐酸盐和13C15N标记的氨基脲同位素标准品 （纯 度99%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色谱 纯， Merck 公司）；甲酸（分析纯， 天津市大茂化学试剂厂） ；无水 Na2SO4 （分析纯， 天津市科密欧化学试剂有限公司）N

7、aH2PO4 （分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；实验用水由MilliQ 纯水仪制备。2.2 标准溶液的配制SEM标准储备液配制：准确称取2.0 mg SEM盐酸盐标准 品，用甲醇溶解并定容至 10 mL棕色容量瓶中，即得200 mg/L 的标准储备液，Symbolm 18 C保存。SEM同位素内标储备液配制：准确称取2.0 mg SEM同位素内标标准品，用甲醇溶解并定容 至10 mL棕色容量瓶中，即得 200 mg/L内标标准储备液， Symbolm 18C保存。用乙腈逐级稀释 SEM与其同位素标 准品，获得所需浓度标准溶液。2.3 实验方法样品处理：取 2.0 mL水样，加入 40卩L 5.

8、0 mol/L NaOH 溶液使其浓度为0.1 mol/L ,溶解混匀后加入适量 SEM同位素 内标溶液使其浓度为 5卩g/L,再往混合溶液中加入 1.0 mL 乙腈，漩涡振荡 2 min，然后加入1.0 g无水Na2SO4,振荡 提取10 min，然后以10000 r/min离心5min，取上层清液至 15 mL离心管中，再加入 0.2 g无水Na2SO4脱水，取上层清 液于进样瓶中待测。2.4色谱串联质谱分析条件色谱柱：Waters XBridgeTM Amide 色谱柱（150 mm x 2.1mm,3.5 卩 m）;柱温：30 C； 流速：250 卩 L/min ; 流动相：A为0.1

9、%（V/V）甲酸溶液，B为0.1% （V/V）甲酸乙腈溶液；进样量：20卩L;分析时间：12 min。梯度洗脱条件为：0 5 min , 20%40% A; 56 min , 40% A; 6 6.5 min , 40%20% A; 6.512 min , 20% A。电喷雾离子源; 离子源温度： 320C; 传输金属毛细管温度： 350C; 喷雾电压： 3500 V; 扫描模式为：TaegetedSIM，采用正离子扫描模式; 质谱分辨率为 70000; Ctrap 最大 容量（AGC target） : 5X 104; Ctrap 最大注入时间：100ms;鞘气35 unit,辅助气10 u

10、nit,扫描分析时间为 12 min。SEM的精确质量数 76.05054 , 13C15NSEM （同位素标准品） 的精确质量数为 79.04871 。3 结果与分析3.1 色谱分离SEM分子上带有多个氨基（图 1插图），极性强，实验 发现采用常规反相色谱柱（C18 ）进行分离，化合物完全没 有保留。近年来发展的亲水相互作用液相色谱技术被认为是 对传统反相色谱方法的有效补充 15， 16，它集成了反相液 相色谱、正相液相色谱和离子色谱的优点，特别适合于极性 化合物的分离分析。 为此，实验选择 Amide 色谱柱（氨基柱） 作为分离柱，通过优化条件其对SEM有较好的保留。流动相的 pH 值及组

11、成对化合物能否在色谱柱上得到有 效分离至关重要。实验表明，在中性条件下， SEM 未能在色 谱柱上得到有效保留。 由于 SEM 上带有氨基， 其在酸性条件 下能够质子化，这有利于其在氨基柱上的保留，因此采用含 有 0.1%甲酸的水相及有机相作为流动相。 在保持同样的梯度 洗脱条件下，实验比较了甲醇和乙腈两种不同有机相组成对 SEM分离的影响（图1）。如图1A所示，以甲醇作为有机相， 化合物保留较弱， 峰型差， 质谱响应信号弱； 相对于甲醇， 采用乙腈流动相（图1B）,化合物保留得到显著增强，保留 时间由原来的 2.5 min 增加到 3.7 min ，并且峰形得到明显改 善，其质谱信号也相应得

12、到明显提高， 信号强度是甲醇的 46 倍。因此，本实验采用 0.1%甲酸（ A） 0.1%甲酸 /乙腈（ B） 作为流动相体系。3.2 质谱检测条件的优化由于SEM分子上带有多个氨基，在酸性条件下极容易质 子化而带上正电荷，因此采用正离子模式进行检测。 SEM 分 子小（分子量为 75），实验发现采用目前常用的选择离子监 测（MRM）模式进行检测，在低于 10卩g/L时均无法到明 显的质谱信号，这可能是由于其本身分子体积小碰撞后难以 获得高丰度的碎片，故灵敏度差。由于环境水样中的SEM含 量低10，通常在卩g/L水平， 因此采用该方法无法实现对环境水样的有效监测。采用 质谱的选择离子监测（SI

13、M）模式，由于低质量端的干扰物质较多，因此采用低分辨质谱进行检测，其背景响应值高，信噪比低，检测的灵敏度差； 而通过提高质谱的分辨率， 可以有效较少其它化合物的干扰，降低背景的信号值，从而 提高目标物质的信噪比。如图 2A 所示，采用低分辨率的四 极杆质谱进行检测，在同等液相条件下，即使在20卩g/L浓度下，在SEM出峰位置（3.7 min ）检测不到明显的信号， 但是在其出峰位置附近 （保留时间 3.0 mi n ）有一个很大的干 扰峰，该干扰峰在空白溶剂样品中也存在，由此可知，采用 低分辨质谱不仅灵敏度低，而且无法排除干扰容易造成误判； 从图 2B 可见，通过采用四极杆 /静电场轨道阱高分

14、辨率质谱 （质谱分辨率为 70000），3.0 min 处的干扰峰消失了，并且基线水平由 104 降低至 102 水平，从而大大提升了信噪比， 其信噪比达513,实现了 SEM的高灵敏检测。故本实验采用 四极杆 /静电场轨道阱高分辨质谱（分辨率70000），实现了对 SEM 的灵敏检测。3.3 样品前处理条件的选择根据3.1节结果，在乙腈溶液中，SEM能够得到较好的分离与检测，因此选择乙腈作为提取剂。SEM的pKa=10.8，在碱性条件下，可以抑制分子上的氨基质子化，使其极性变 弱，从而有利于被有机溶液萃取。 实验采用 0.2 mol/L 磷酸盐 缓冲溶液，以NaOH为pH值调节剂，考察pH

15、（ 613）对 SEM提取的影响。由图3可见，pH13后，提取率趋于稳定。SEM为酰胺类物质，溶液碱性太强，会导致其水解。因此实 验最终确定通过在样品中加入 NaOH 溶液，并使其浓度为 0.1 mol/L （ pH- 13）,使SEM能被乙腈有效提取。亲水作用色谱分离体系对于样品溶液的含水量非常敏 感21 ，少量水即可导致色谱峰型变差，影响样品的分离。 对于乙腈提取液虽然已经通过盐析作用使乙腈层与水层得 到分离，但提取液中依然含有少量水，因此需要在提取液中 再加入少量无水Na2SO4进行二次脱水，以避免水分对分离 的影响。3.4 工作曲线及检出限在最佳测定条件下测定系列 SEM的标准溶液，其

16、浓度 分别为 0,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 和 20.0 卩g/L ,用同位素内标法进行定量，以定量离子的峰面积与同位素内标的峰峰面积（y）对含量（x）进行线性回归计算，结 果表明在0.220.0卩g/kg范围内线性关系良好，线性方程 为 y=0.07312x+0.007655 （R2=0.997）,以 3 倍信噪比（S/N=3） 作为方法的检出限（LOD）、10倍信噪比（S/N=10）作为方法 的定量限（LOQ）,测得SEM的LOD为0.09卩g/L、LOQ为 0.30 p, g/L o以阴性淡水和海水为空白样， 添加水平分别为 0.5， 1.0 和5.0 p g/L

17、 ,每个添加水平平行测定 6个样品，进行回收率 和相对标准偏差测试，结果如表 1所示。方法的回收率为82.3% 92.0%, RSD3.5实际水样SEM的测定采集深圳地区不同位置的 3 份海水样品及 3份河流水样 运用本方法进行检测，在其中1份河水样品检测出 SEM含量 0.81卩g/L，海水样品中未检出 SEM。4 结 论采用亲水作用液相色谱四极杆 /轨道阱高分辨质谱技术， 结合同位素质谱定量技术，建立了快速测定水样中痕量SEM污染物的新方法。 与目前所报道的高效液相色谱/串联质谱法相比，本方法更为快速、简便，可满足环境中水中痕量SEM的污染分析。References1YANG JiChun

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