动物细胞工程实验指导讲解

1、实验时间实验内容4月11日实验一 培养用液的配制、除菌与分装4月18日实验二 细胞的传代培养4月25日实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（ 1-5组） 401实验四 染色体制备（ 6-10 组） 3015月 2日实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（ 6-10组） 401实验四 染色体制备（ 1-5 组） 3015月 9日实验五 细胞的复苏与冻存1实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。2. 掌握常用的灭菌方法。3. 了解每种培养用液的作用。【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液

2、体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和 EDTA 溶液。 PBS 用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA 。培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM和 L-15 ；用于动物的一般是DMEM和 RPMI-1640 。胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25% 或 0.125% 。EDTA用于清洗细胞表面，螯合Ca 2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和 EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。【试剂、材料与仪器】试剂

3、： NaCl ，KCl ， Na2HPO 4，KH 2PO4， EDTA ，胰蛋白酶，HEPES ，碳酸氢钠，盐酸， MEM或 PRMI-1640培养基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL 、1000 mL ），玻棒，精密pH试纸（ 6.8-8.0），容量瓶（250 mL 、 1000 mL ），移液管（ 5 mL 、 10 mL ），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（ 500 mL 、 250 mL 、 100 mL ），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液

4、枪，4冰箱【实验分组】实验分组进行，每组 4人，每班 20人，共分 5组。配制 PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制 EDTA 溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL ；EDTA50 mL ；培养基 90 mL （使用前加入 10 mL 血清）。【实验步骤】1 PBS（ 1000mL ）的配制分别称取NaCl 8g； KCl 0.2g ；Na2HPO 412H 2O 2.9g ；KH 2PO 4 0.2g 于烧杯，加入800mL 三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL 容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS用于 2

5、 胰蛋白酶溶液和3 EDTA 溶液的配制，余下高压灭菌备用。22胰蛋白酶溶液（ 0.25% ）的配制、除菌与分装称取 0.625g 胰蛋白酶于 250 mL 烧杯，加入 1 配制的 PBS 200 mL ，玻棒搅拌充分溶解后，倒入 250 mL 容量瓶中，用 PBS 定容至刻度。拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶（ 100 mL ），每瓶 50 mL 。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放 4 冰箱保存备用。标签上标明：0.25% 胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。3 EDTA （ 0.2）的配制、除菌与分装称取 0.5 g EDTA 于 250 mL 烧杯

6、，加入 1 配制的 PBS 200 mL ，溶解时加少量 NaHCO3，调整 pH 为 8.0，玻棒搅拌使 EDTA 充分溶解。 再用 PBS 定容到 250 mL 容量瓶里， 终浓度为 0.2% ，用浓盐酸， 调 pH 为 7.2-7.4。装于 250 mL 试剂瓶中，高压灭菌备用。在超净工作台内， 将已灭菌的EDTA 溶液分装至5 个无菌试剂瓶（ 100 mL ），每瓶 50 mL 。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 冰箱保存备用。标签上标明： 0.2% EDTA 、配制日期、以及组号与组长姓名。4培养基的配制、除菌与分装将培养基干粉（MEM或 PRMI-1640

7、 ）倒入 1000 mL 烧杯，加 800mL 三蒸水，玻棒搅拌充分溶解； 再加入加1.8g HEPES 和 2.2g 碳酸氢钠， 玻棒搅拌充分溶解，溶液呈橙色 （弱酸性， pH 在 7.0 左右）；再倒入 1000 mL 容量瓶，用三蒸水定容至刻度。工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌 30 分钟后， 关闭紫外灯， 打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5 个无菌试剂瓶 （100 mL ），每瓶 90 mL ，余下装入500 mL 无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GP

8、S（谷氨酰胺 -青霉素 -链霉素），轻轻摇匀，使之终浓度为1% 。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放 4 冰箱保存备用。标签上标明： MEM 或 PRMI-1640 、配制日期、以及组号与组长姓名。用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长培养基内血清浓度为10% 。【注意事项】1. 滤过除菌时，将容量瓶内的液体倒入烧杯内，再拿到超净台里，采用一次性滤器或是抽滤法除菌。2. 培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末，也可在过滤除菌后加入无菌的液体，终浓度为 100 U/mL 青霉素和 100 g/mL链霉素。【思考题】1.配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物质，

9、为什么？如何调节培养液的pH ？2. 生长培养基中的血清一般在什么时候添加，为什么？3. 细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法有哪些，如何使用？3实验二细胞的传代培养【实验目的】1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。2. 了解细胞传代培养的意义。【实验原理】细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细

10、胞供实验所需。传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25-28 ，冷水鱼类细胞为15-20，水生哺乳动物细胞为37。细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。单纯换液不需要接种细胞。【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基 （ PRMI-1640或 MEM ，添加 10%小牛血清或胎牛血清） ，0.2

11、5%胰蛋白酶， 0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL 、 10 mL ），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或 CO 2 培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机， 4冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4 人，每班20 人，共分5 组。【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌 30 分钟后， 关闭紫外灯， 打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。1 观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态

12、，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；2 超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于4超净工作台酒精灯左侧；3 开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，将培养瓶内液体（旧培养基）倒入 15 mL 离心管， 3000 rpm/min 离心 5 min 备用。培养瓶瓶口、瓶盖以及离心管管口、管盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4 清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（ 5mL ）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品） ，安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。酌情吸取 2-4 mL EDTA 溶液，清洗

13、细胞表面，去掉残留的旧培养基以及漂浮的死细胞，再倒弃 EDTA 溶液；5 胰酶消化：用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶，从培养瓶侧面加入细胞培养瓶内，盖好瓶盖后，在倒置显微镜下观察，当80% 的细胞收回突起变圆时，立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶；6 中和消化：用移液管吸取旧培养基上清液3 mL （也可用新鲜生长培养基），加入细胞培养瓶中，终止胰酶消化，并反复轻轻吹打消化好的细胞使其脱离瓶壁并分散；7 沉淀细胞：将细胞悬液吸入15 mL 的离心管中， 1000 rpm/min 离心 8 分钟，获得细胞沉淀；8 加入新鲜培养基：倒弃上清液，保留细胞沉淀（注意只能倒一次，不能反复倒），然后用另一新移液管

14、吸取10 mL 的新鲜培养基加入培养瓶中5mL ，余下 5mL 加入离心管内悬浮细胞沉淀，吸取离心管中的细胞悬液加入细胞培养瓶中，与另外5mL 培养基混匀；9 接种细胞：吸取5 mL 上述的细胞悬液，加入另一个新细胞培养瓶中，接种后2 个培养瓶中的悬液各 5 mL；10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置培养（如果放入CO 2 培养箱，瓶盖拧紧后再稍回转）；11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进行第2 代的传代。【注意事项】1. 传代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶

15、内。要防止细胞之间的交叉污染，每次最好只进行一种细胞的操作，每一种细胞使用一套器材。每种试剂使用一个移液管，培养用液要严格分开。2. 坚持每天观察细胞，生长致密时即可传代。如发现有污染迹象，应丢弃污染的细胞。3. 细胞消化时要注意观察，不要消化过度，否则细胞不宜存活。吹打细胞时，确保瓶壁所有地方均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，以防细胞破碎。4. 培养箱不要反复多次开关，以免影响温度的稳定和增加污染的机率。【思考题】1. 贴壁细胞的传代培养方法及注意事项。2. 常用的细胞消化液有哪些？各种消化液的作用原理分别是什么？3. 悬浮生长的细胞如何传代培养？5实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）

16、【实验目的】1. 掌握鱼类细胞原代培养的组织块法。2. 了解细胞原代培养的酶消化法和机械分离法。【实验原理】细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养常用方法有组织块法、酶消化法和机械分离法等。组织块法是直接从生物体获取组织，切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶底部，通过培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让组织块周边慢慢地长出细胞来，经消化传代，获得大量均一的细胞，用于传代培养和相关细胞实验。【试剂、材料与仪器】试剂： MEM培养基， GPS，两性霉素B，硫酸庆大霉素，表皮生长因子（EGF ），成纤维生长因子（FGF ）材料：试验幼鱼，原代培养瓶，无菌培养皿，移液管（5 mL ），无菌离心管（

17、15 ml ），解剖探针，手术剪，眼科剪，眼科镊，手术刀，医用酒精，烧杯（250 mL ），废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO 2 培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，4冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4 人，每班20 人，共分5 组，每组中分别取肌肉、鳍条、肝和鳔4 种组织。【实验步骤】1. 试剂配制抗生素培养基（AIM ）： 90 mL 培养液（ 2MEM ） + 5 mL GPS （ 10） +5 mL 两性霉素 B（ 250 g/mL） +1 mL 硫酸庆大霉素（ 50 mg/mL ）混合， 4保存备用。原代培养基

18、： 80 mL 培养液+ 2 mL GPS (10 ) + 20 mL FBS + EGF （ 2 g/mL）+ FGF（ 25 ng/mL ）混合， 4保存备用。传代培养基：90 mL 培养液+ 1 mL GPS (10 ) + 10 mL FBS 混合， 4保存备用。2. 组织分离和细胞培养工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌 30 分钟后， 关闭紫外灯， 打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好培养皿、移液管和培养瓶。将灭过菌的手术器械（解剖刀2 把，眼科镊2 把，眼科剪1 把）插入盛有医用酒精的玻璃烧杯中浸泡备用。

19、以下操作均在超净台里进行：1) 杀幼鱼与消毒体表：用解剖探针破坏幼鱼脑后，将幼鱼置于酒精中，浸泡30 秒。62) 取肌肉与鳍条： 用消毒纱布托住鱼体， 用手术剪取下鳍条或背部肌肉， 并置于盛有 AIM 培养基的培养皿（ 1）内浸泡消毒，培养皿上写上组织名称。3) 用纱布擦去手术器械上的残余组织，将手术器械放入盛有医用酒精的烧杯中涮洗浸泡。用眼科剪打开体腔，用眼科镊取出肝或鳔，并置于盛有AIM的培养皿（ 2）内浸泡消毒，培养皿上写上组织名称。注意：取体表和体内不同的组织时，手术器械应分开并浸泡消毒，防止组织细胞交叉污染。4)组织块在 AIM内浸泡 2 小时，每半小时换1 次 AIM 培养基。换液

20、方法：涮洗AIM中的组织块，倒去旧液，用移液管吸取新鲜AIM 加入培养皿内。5) 用眼科镊夹取组织块，移入无菌培养皿（3）内，用手术刀切除和刮去多余的组织，如脂肪和坏死组织，血液、筋膜等，再用新移液管吸AIM 清洗组织块1-2 次。6) 将组织块移入无菌培养皿（ 4）内，用手术刀将组织块切成约 1mm2 的小块，用新移液管吸取 AIM 少量，将组织碎块浸润。7) 打开培养瓶盖，用新移液管吸取湿润的微小组织块（约20-30 个），接种于 25 cm2 培养瓶底部，用移液管将组织块涂抹均匀，培养瓶瓶口和瓶盖过酒精灯火焰后再盖好拧紧，培养瓶上做好标记（包括组织名称和原代培养日期）。8) 将培养瓶拿到

21、培养箱内，静置贴壁 2 小时，再将培养瓶侧放半小时，用移液管将残余液体吸出。9) 用新移液管从细胞培养瓶侧面缓慢加入 4-5 mL 原代 培养基， 培养瓶保持竖立， 培养瓶瓶口和瓶盖过酒精灯火焰后再盖好拧紧。小心将细胞培养瓶拿入培养箱内，缓慢轻柔地将培养瓶平放（让培养基慢慢浸润组织块，避免组织块脱离瓶壁漂浮），静置培养。10)注意观察细胞生长情况，大约 1-2 周后， 细胞开始从组织块底部延伸出来。当细胞长满时，可消化传代，原瓶可保留继续生长细胞。【注意事项】1 尽量选取幼年的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如幼鱼、胚胎、肿瘤组织等，作为实验材料。2 原代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量

22、靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶内。要防止组织之间的交叉污染，注意更换移液管。3 组织块要静置贴壁2 小时，能黏附于瓶壁时，再与加入培养液，操作要轻且缓慢，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有贴壁，细胞则不易生长。 如组织块漂浮， 需重新贴壁！【思考题】1. 细胞原代培养（组织块法）的方法及注意事项。2. 常用的细胞原代培养方法有哪些？分别适用于哪些组织？7实验四细胞的冻存【实验目的】1.掌握细胞保存的方法2.熟悉细胞冻存的原理【实验原理】细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞特性，在需要的时候

23、再复苏细胞用于实验。冻存细胞还起到了细胞保种的作用，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种。细胞冻存时向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO ，终浓度5 - 15% ），可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用 “慢冻快融 ”的方法能较好地保证细胞的存活。标准冷冻速度开始为-1- -2 /min ，当温度低于 - 25时可加速，到- 80之后可直接投入液氮内（-196 ）。【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基 （ PRMI-1640或 MEM ，添加 10%小牛血清或胎牛血清） ，0.25%胰蛋白酶， 0.2% EDTA ，

24、二甲基亚砜（DMSO ），液氮，异丙醇材料：冻 存管，移液管（ 2 mL 、5 mL ），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4冰箱， -80冰箱，程序降温盒，液氮罐，制冰机【实验分组】实验分组进行，每组4 人，每班20 人，共分5 组。【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌 30 分钟后， 关闭紫外灯， 打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。程序降温盒盛装异丙醇，使用前4预冷。在超净工作台中摆放好冻存管、移液管、离心

25、管和试剂瓶。冻存管上作好标记，包括细胞名称，代数和冻存日期。1.收集细胞：取待冻存的细胞，倒弃旧液，用移液管吸取2-4 mL EDTA 清洗细胞表面，弃去，再吸取2 mL 胰蛋白酶加入细胞培养瓶，消化1-2 分钟，轻轻拍打瓶侧，使细胞脱离瓶底。加入2 mL 培养基将细胞轻轻吹打冲洗下来，移入15 mL 离心管， 10008rpm/min 离心 7 min ，弃上清，保留离心管底部细胞沉淀。2.细胞冻存液的配制：在 15 mL 离心管中依次加入： DMSO 0.6 mL 、新鲜培养液1.8 mL和血清 0.6 mL ，作为 A 液（ 3 mL ）。轻轻吹打混匀，离心管加盖后立即插入冰里。注意吸取

26、试剂时，移液管均需更换，不能混用。3.冻存细胞：在 1 步获得的细胞沉淀中，加入3 mL 培养液，轻轻吹打混匀，制成细胞悬浮（ B 液）。吸取细胞悬液（ B 液）与 A 液均匀混合。混合时，从离心管底部向上缓慢拖着滴加，边加边转动移液管，使细胞与冻存液充分混匀。混合后细胞悬液为6 mL ，分装于冻存管中，每管1-1.5 mL ，盖好冻存管盖，放入盛有异丙醇的程序降温盒中，立即放入 -80， 24 小时后，将装有细胞的冻存管转移到液氮内，并做好记录。【注意事项】1 冻存液需现配现用，配制好后放置在冰中，保持低温。冻存液中含20% 血清和 10%DMSO ，配制时添加血清和DMSO 要错开，即血清

27、和 DMSO 二者不能直接混合。2 程序降温盒要提前装好异丙醇，且4预冷。3 冻存管内细胞的密度通常为105-106 个 / mL ，一般铺满一个25 cm2 的细胞培养瓶的细胞量可以冻存 1-2mL 。4 准备进行冻存的细胞，要处于对数生长期，即细胞传代后24h 左右，且细胞生长状态良好，这样才能保证冻存细胞复苏时，有较高的存活率。5 要准确记录冻存细胞的种类，代数，冻存时间和冻存者的姓名。【思考题】1 为什么要配制细胞冻存（A 液），并将细胞悬液（B 液）与之混合？2 冻存细胞时，为什么要加入二甲基亚砜？为什么要缓慢降温？9实验五细胞的复苏【实验目的】1. 掌握细胞复苏的方法2. 熟悉细胞

28、复苏的原理【实验原理】细胞复苏时要快速融化，必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化，使细胞冻存时产生的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。复苏后的细胞可继续进行传代增殖，做实验材料和再次冻存。【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640或 MEM ，添加 10%小牛血清或胎牛血清）材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL 、 10 mL ），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO 2 培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，水浴锅，液氮罐【实验分组】实验分组进

29、行，每组4 人，每班20 人，共分5 组。【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌 30 分钟后， 关闭紫外灯， 打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。将水浴锅预热至 37，在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶。1.取出冻存管： 根据细胞冻存记录找到所需细胞存放之处，从液氮罐中取出待复苏细胞。2.迅速解冻：立即将冻存管放入37温水中迅速解冻，要不断晃动冻存管，大约在1min内使冻存管内液体完全溶解。取出冻存管，酒精喷洒擦拭冻存管盖周边，拿入超净工作台。3.加培养液：吸取冻存管内的细胞悬液，加入离心管，再向离心管内加入5-8 m

30、L 生长培养液， 1000 rpm/min 离心 8min，获得细胞沉淀。倒弃上清，加入4-5 mL 生长培养基，轻轻吹打混匀细胞，将细胞移入细胞培养瓶。4. 贴壁与换液： 将细胞于培养箱中静置培养 24 小时，观察细胞贴壁情况。 吸去旧液， 加入新鲜生长培养基。10【注意事项】1. 细胞复苏时，注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（ -5 0）。这样复苏的冻存细胞存活率高，细胞生长及形态良好。2.由于冻存的细胞中会有部分细胞死亡，静置培养24 小时后，可将不贴壁、飘浮在培养液上的死细胞弃去，更换新鲜培养液。3. 如果冻存的细胞保存时间较长或之前细胞复苏时，

31、细胞存活率不高，可以直接在培养瓶内加入冻存管内的细胞悬液和5 mL 的新鲜培养基，静置培养10-12h 后，更换新鲜培养基。【思考题】1 复苏细胞时，为什么要快速融化？2 如果冻存管内的细胞密度偏低，复苏时如何处理？11实验六染色体制备【实验目的】1. 掌握培养细胞的染色体的制备方法2. 熟悉细胞染色体制备的原理【实验原理】每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基 （ PRMI-1640或 MEM ，添加 10%小牛血清或胎牛血清） ，0.25%胰蛋白酶， 0.2% EDTA ， PBS，冰醋酸，甲醇，秋水仙碱，95% 乙醇， HCl， Giemsa 染液，双蒸水材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL 、10 mL ），无菌离心管，载玻片，胶头滴管，染色缸，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或 CO 2 培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，切片烘干机，制冰机，水浴锅【实验分组】实验分组