离子通道药物筛选策略50中国药科大学药物筛选课件

1、离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 1 五、离子通道药物筛选五、离子通道药物筛选 (Screening strategies for ion channel targets) I. Introduction Ion Channel Play a central role in human physiology Help regulate cellular ion homostasis Adjust the electrical activity of nerve and muscle cells 3) Control the release of transmitters and

2、hormones. 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 2 Modulation of ion channel activity represents an effective therapeutic strategy for a wide variety of disorders. 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 3 II. Ion channel function Form a narrow aqueous pore spanning the membrane that selectively allows the passage of one or a few

3、 classes of ions, e.g. Na+, K+, Ca2+, or Cl-. 2. They are gated pores, allowing controlled, rather than continuous, ion flux. Gating mechanisms: “ligand-binding” (ligand-gated), “voltage-dependent mechanism (voltage-gated) 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 4 III. Ion channel-related disease Long-QT syndromes

4、(遗传性长QT综合症） (K+ ) Defects in cardiac K+ channels (occur in only 1 in 15,000 individuals and result in cardiac arrhythmia (心律失常) and sudden death). Deafness （耳聋)、Hyperinsulinemia (高胰岛素症) (K+ ) Cystic fibrosis (囊肿纤维化) 、Myopathies (肌肉病变) (Cl+ ) Hereditary hypertension (遗传性高血压) (Na+) Periodic paralysis

5、(周期性瘫痪) (Na+) Malignant hyperthermia (恶性高热) (Ca2+) 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 5 【相关报道】【相关报道】 美国两位科学家获美国两位科学家获2003年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 6 IV. Established assay methods Simple blockers or openers, modulatory compounds. Detect modulation of any of the properties: signal conductance, direc

6、tionality, ion selectively, gating dependence on the binding of a ligand or membrane potential, and desensitization 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 7 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 8 六、抗六、抗HIV药物筛选药物筛选 艾滋病由一种逆转录病毒引起的艾滋病由一种逆转录病毒引起的 1 1）19831983年著名的法国巴斯德研究所肿瘤病毒室主任年著名的法国巴斯德研究所肿瘤病毒室主任蒙嗒尼尔蒙嗒尼尔 (Montagnier)(Montagnier)首先

7、从一名患淋巴结病综合症的男性同性恋者的首先从一名患淋巴结病综合症的男性同性恋者的 淋巴结中分离到一种艾滋病的淋巴结中分离到一种艾滋病的淋巴结病相关病毒淋巴结病相关病毒 (Lymphaenopathy Associated Virus)(Lymphaenopathy Associated Virus)简称简称LAVLAV。 2 2）19841984年美国国立肿瘤研究所的研究人员也报告从艾滋病病年美国国立肿瘤研究所的研究人员也报告从艾滋病病 人血液标本中分离到多株逆转录病毒，命名为人血液标本中分离到多株逆转录病毒，命名为嗜人嗜人THTH淋巴细胞淋巴细胞 三型病毒三型病毒(Human T-Lymph

8、otrophic Virus)(Human T-Lymphotrophic Virus)简称简称HTLV-HTLV-。 这两种病毒被认为是同一种逆转录病毒的变种，并肯定为引起这两种病毒被认为是同一种逆转录病毒的变种，并肯定为引起 艾滋病的病原体、把它称为艾滋病的病原体、把它称为LAV/LTLV-LAV/LTLV-。 1、HIV简介简介 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 9 1986年年7 7月月2525日日，世界卫生组织，世界卫生组织(WHO)(WHO)发布公报，发布公报， 国际病毒分类委员会会议决定，将艾滋病病毒改国际病毒分类委员会会议决定，将艾滋病病毒改 称为称为人类免疫缺陷

9、病毒人类免疫缺陷病毒 (Hmuan Immunodeficiency Virus) (Hmuan Immunodeficiency Virus) 简称简称HIVHIV。 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 10 HIV呈袋状球形，直径约呈袋状球形，直径约150毫微米，包膜由一薄层毫微米，包膜由一薄层 类脂质构成，具有抗原性。类脂质构成，具有抗原性。HIV有有10%碱基序列不同。碱基序列不同。 是是单链单链RNA病毒病毒，外有核壳蛋白，此外还有一种特殊，外有核壳蛋白，此外还有一种特殊 的逆转录酶，能以单链的逆转录酶，能以单链RNA作为模块，转录为双链作为模块，转录为双链 DNA，该双

10、链，该双链DNA可与宿主细胞的可与宿主细胞的DNA结合然后逆结合然后逆 转录为病毒的单链转录为病毒的单链DNA，因此，因此感染艾滋病病毒后，病感染艾滋病病毒后，病 毒的核酸永远与宿主细胞结合在一起，使得感染不能毒的核酸永远与宿主细胞结合在一起，使得感染不能 消失，机体无法清除病毒。消失，机体无法清除病毒。 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 11 NC：核壳蛋白：核壳蛋白 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 12 HIV picture 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 13 HIV由皮肤破口或粘膜进入人体血液，主要攻击和破坏的由皮肤破口或粘膜进入人体血液

11、，主要攻击和破坏的 靶细胞靶细胞T4淋巴细胞淋巴细胞(T4淋巴细胞在细胞免疫系统中起着中淋巴细胞在细胞免疫系统中起着中 心调节作用，它能促进心调节作用，它能促进B细胞产生抗体细胞产生抗体)，使得，使得T4细胞失细胞失 去原有的正常免疫功能。当激活免疫反应的去原有的正常免疫功能。当激活免疫反应的T4细胞几乎细胞几乎 全部被全部被HIV消除，消除，T4细胞抑制细胞在数量上巨增，相反病细胞抑制细胞在数量上巨增，相反病 人体内人体内T4细胞在数量上骤减，从而导致病人的免疫功能细胞在数量上骤减，从而导致病人的免疫功能 全部衰竭，为条件性感染创造了极为有利的条件。全部衰竭，为条件性感染创造了极为有利的条件

12、。 HIV是嗜是嗜T4淋巴细胞和嗜神经细胞的病毒。淋巴细胞和嗜神经细胞的病毒。 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 14 The Threat of HIV/AIDS in China According to figures from the Ministry of Public Health, around 850,000 people in China have been infected by the HIV virus since the deadly disease was first detected in the country in 1985. The total

13、 number of people to develop full- blown AIDS is estimated to have reached around 200,000, only 80,000 and 100,000 of whom are still alive, hiding their conditions for fear of discrimination and unable to afford AIDS drugs. 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 15 In the first half of 2002, reported cases of HIV

14、infection rose in China at a rate of 16.7% compared with the same period of 2001. The World Health Organization has warned that China could have over 10 million HIV/AIDS carriers by the year 2010 if no efficient measures to counter the spread of the disease are taken. According to the Ministry of He

15、alth, the sharing of needles among intravenous drug users caused 68 percent of confirmed HIV cases, while unclean blood collecting and transfusions are responsible for 9.7 percent. Another 7.2 percent of HIV carriers contracted the disease through unsafe or unprotected sex. 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 1

16、6 The central governments budget for the prevention of AIDS has increased from 15 million yuan in 2001 to 100 million yuan. A total of 1.25 billion yuan in national bonds has been issued to strengthen supervision of the construction of blood banks in western regions of China, where more people have

17、HIV than in other parts of the country。 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 17 2、HIV life cycle 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 18 3 3、抗、抗HIVHIV药物设计与筛选药物设计与筛选 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 19 1 1）病毒与靶细胞结合阻止剂）病毒与靶细胞结合阻止剂 （ HIV-gp41, CD4）(invasion) 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 20 HIVHIV与靶细胞膜表面的与靶细胞膜表面的CD4CD4受体结合。受体结合。 该类药物设计的着眼点放在特

18、异性作用于病毒蛋白（尤其该类药物设计的着眼点放在特异性作用于病毒蛋白（尤其 是被膜蛋白）或靶细胞是被膜蛋白）或靶细胞T4T4抗原，病毒结合位点以及能干扰抗原，病毒结合位点以及能干扰 病毒被膜的完整上。病毒被膜的完整上。 HIVHIV病毒利用其表面的病毒利用其表面的gp160gp160蛋白辨认宿主细胞膜。蛋白辨认宿主细胞膜。 gp160gp160蛋白由蛋白由gp120gp120与与gp41gp41組成。（組成。（gp120gp120功能为辨认，功能为辨认， gp41gp41功能为伸入宿主細胞膜，結合病毒細胞膜）。功能为伸入宿主細胞膜，結合病毒細胞膜）。 利用药物抑制利用药物抑制gp41gp41的

19、作用，也是目前的一种治疗方法。的作用，也是目前的一种治疗方法。 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 21 药物筛选策略药物筛选策略 寻找特异性结合寻找特异性结合 gp41,gp120, CD4蛋白的化合物蛋白的化合物 “第三者第三者”插插 足？足？ SPR 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 22 Virus adsorption (gp 120) inhibitors 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 23 Virus adsorption (gp 120) inhibitors 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 24 Viral fusi

20、on (gp 41) inhibitors 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 25 2 2） HIVHIV病毒逆转录酶抑制剂病毒逆转录酶抑制剂 (HIV-RT)(HIV-RT)(replication)(replication) 病毒进入靶细胞后，其逆转录酶病毒进入靶细胞后，其逆转录酶RT是催化产生正链是催化产生正链DNA共聚物共聚物 的关键。因此，该类药物设计的最佳靶点为逆转录酶。目前批的关键。因此，该类药物设计的最佳靶点为逆转录酶。目前批 准上市的五个药物均基于这一着眼点，但它们均属于核甙类化准上市的五个药物均基于这一着眼点，但它们均属于核甙类化 学药物，毒副作用大，选择性不

21、高，且有耐药菌珠出现，故都学药物，毒副作用大，选择性不高，且有耐药菌珠出现，故都 面临被淘汰的危险。面临被淘汰的危险。因此，具有选择性高的非核甙类因此，具有选择性高的非核甙类RT抑制剂抑制剂 是未来抗是未来抗HIV药物的研究热点之一。药物的研究热点之一。 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 26 HIV逆转录酶（逆转录酶（HIV RT)基本特征基本特征 RT是由是由p66和和p51两个亚基组成的异源二聚体，两两个亚基组成的异源二聚体，两 亚基亚基N端序列相同，端序列相同，p51比比p66缺少了缺少了C端的端的Rnase H 活性区活性区 RT从结构上分为聚合酶活性区和从结构上分为聚

22、合酶活性区和Rnase H 区两个区两个 domain，前者又分为，前者又分为 4 subdomains-finger， palm, thumb, connection 两个两个domain对应对应RT的两种不同酶活性：的两种不同酶活性：RNA- or DNA- dependent DNA polymerase activity 和和 ribonuclease (Rnase) H activity 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 27 p66-in color; p51-in gray 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 28 RT的功能的功能 RT在在HIV病毒生

23、活史中将病毒生活史中将HIV的单链的单链RNA基基 因组反转成为双链因组反转成为双链DNA RT是治疗是治疗AIDS的重要靶标，抑制的重要靶标，抑制RT的活性成的活性成 为为AIDS治疗的主要手段治疗的主要手段 目前的药物主要针对目前的药物主要针对RT的聚合酶活性的聚合酶活性 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 29 筛选筛选RT抑制剂的方法抑制剂的方法 同位素应用的方法同位素应用的方法 有较大的局限性有较大的局限性 非同位素方法非同位素方法 比色法比色法Colorometry 荧光法荧光法Fluorescence 发光法发光法Luminescence 时间分辨荧光时间分辨荧光 H

24、TRF(homogeneous time- resolved fluorescence) 闪烁亲和测定闪烁亲和测定(scintillation proximity assay,SPA) SPR 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 30 RT主要的抑制剂主要的抑制剂 RT抑制剂分为两类抑制剂分为两类 Nucleoside RT inhibitors (NRTIs)核苷类核苷类: 10 个上市个上市-AZT, Ziagen, Epivir, Viread, Trizivir, Combivir, Zerit, Videx EC, HIVID, Retrovir Nonnucleosid

25、e RT inhibits (NNRTIs)非核非核 苷类：苷类： 3 个上市个上市-Rescriper, Sustiva, Viramune 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 31 NNRTI非核苷类抑制剂与非核苷类抑制剂与RT结合示意图结合示意图 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 32 3 3） HIV-HIV-整合酶抑制剂筛选整合酶抑制剂筛选 (HIV-Integrase)(HIV-Integrase) 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 33 整合酶的基本功能、性质整合酶的基本功能、性质 HIV 整合酶（整合酶（Integrase,IN) ： H

26、IV 第三酶第三酶 HIV病毒病毒pol基因基因3 端编码端编码 32KDal 三个结构域（晶体结构均已解析）三个结构域（晶体结构均已解析） 基本功能：基本功能： 催化病毒复制基本步骤病毒双链催化病毒复制基本步骤病毒双链DNA 整合到宿主整合到宿主DNA 作为治疗作为治疗AIDS靶标优点：靶标优点： 人体内尚未发现该酶类似物人体内尚未发现该酶类似物 B A C 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 34 病毒双链病毒双链DNA 整合到宿主整合到宿主DNA 整合酶作用部位整合酶作用部位 1. 形成整合酶、病毒形成整合酶、病毒DNA复合物复合物 2. 剪切病毒剪切病毒DNA 3 末端末端

27、 3. 转移病毒转移病毒DNA 4. 剪切细胞剪切细胞DNA 5. 连接病毒连接病毒DNA 和细胞和细胞DNA 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 35 药物筛选方法药物筛选方法 SPA: Scintillation Proximity Assay SPA Bead 3H L-731,988 DNA FLAG-integrase Biotinylated anti-FLAG antibody Amy S. Espeseth et al. (2000) PNAS SPA Bead 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 36 主要抑制剂主要抑制剂 Diketo acids 类

28、类 L-731,988. Ryan Reinke et al (2002) A.A.C. Daria J. Hazuda et al (2000) science 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 37 4 4） Drug Screening based on Drug Screening based on Interaction of CypA and HIV capsid 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 38 Packaging of cyclophilin A (CypA) into HIV-1 virions is essential for effici

29、ent replication. Incorporation of CypA into viral particles is mediated through binding to the Gly-89-Pro-90 peptide bond of the N- terminal domain of HIV-1 capsid (CAN) at a CypA: CA ration of about 1:10 . 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 39 Identification of resides within CAN that change in chemical shift

30、 on binding and catalysis by CypA. CypA (blue) is shown bound to the flexible loop between Pro-85 and Pro-93 of CAN (yellow). Backbone amides of CAN that shift on CypA binding by more than 14Hz are highlight in red. Proline within CAN(1- 146) are shown in green. 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 40 Disruption

31、 of CypA incorporation into HIV-1 virions by CSA correlates with inhibition of HIV-1 DNA synthesis Jurkat cells were infected with viral stocks produced in the presence of 0,0.5,2.5uM CSA,as indicated. Virions were pelleted from drug-containing medium and used to infect cells in the absence of the d

32、rug. PCR was performed and phosphorImager quantitation of products shown . 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 41 七、七、 基于基于COXCOX2/5-LOX2/5-LOX为靶点的为靶点的 抗炎药物筛选抗炎药物筛选 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 42 炎症反应炎症反应 被 多 种 炎 症 介 质 所 介 导 ， 其 中被 多 种 炎 症 介 质 所 介 导 ， 其 中 花 生 四 烯 酸花 生 四 烯 酸 （Arachidonic Acid，AA）的代谢产物）的代谢产物前列腺素前列腺素

33、（PGs）和）和白三烯白三烯（LTs）是其中重要的两个炎症介）是其中重要的两个炎症介 质。质。 离子通道药物筛选策略50中国药科 大学药物筛选 43 Arachidonic acid cox-2 COX-1 PGH2 PGI2 PGE2 PGD2 PGF 2 TxA2 LTs 5-LOX PLA2 膜磷酸酯经由磷酸酯膜磷酸酯经由磷酸酯A2(PLA2)产生游离的花生四烯酸产生游离的花生四烯酸(AA), 环加氧酶环加氧酶(COX- 1和和COX-2) 将将AA转化为前列腺素转化为前列腺素G2 (PG2), 接着将其产物转化为前列腺素接着将其产物转化为前列腺素 H2(PGH2), 组织特异性的同功酶将组织特异性的同功酶将PGH2代谢为前列