分子生物学讲座课件

1、分子生物学讲座课件 第二节第二节 基因工程载体基因工程载体 一、作为载体的条件：一、作为载体的条件： 分离的基因自身不能繁殖，需要载体携分离的基因自身不能繁殖，需要载体携 带它们到合适的细胞中复制和表现功能。带它们到合适的细胞中复制和表现功能。 对理想的基因工程载体一般至少有以下几对理想的基因工程载体一般至少有以下几 点要求。点要求。 分子生物学讲座课件 能在宿主细胞中复制，而且最好要有较能在宿主细胞中复制，而且最好要有较 高的复制能力。高的复制能力。 容易进入宿主细胞，而且进入效率越高容易进入宿主细胞，而且进入效率越高 越好。越好。 容易插入外来核酸片段，插入后不影响容易插入外来核酸片段，插

2、入后不影响 其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要 求载体上要有合适的酶切位点。求载体上要有合适的酶切位点。 容易从宿主细胞中分离纯化出来。容易从宿主细胞中分离纯化出来。 有容易被识别筛选的标志。有容易被识别筛选的标志。 分子生物学讲座课件 二、载体的种类二、载体的种类 按照性质分：按照性质分： 质粒载体质粒载体 病毒载体病毒载体 按照功能分：按照功能分： 克隆载体克隆载体 表达载体表达载体 穿梭载体穿梭载体 分子生物学讲座课件 常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 一、质粒载体一、质粒载体 质粒（质粒（plasmid）是细

3、菌或细胞染色质以外的，）是细菌或细胞染色质以外的， 能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。 其特点如下：其特点如下： 是染色体外的双链共价闭合环形是染色体外的双链共价闭合环形DNA （covalently closed circuar DNA,cccDNA），可），可 自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb 之间，之间，15kb的小质粒比较容易分离纯化，的小质粒比较容易分离纯化， 15kb的大质粒则不易提取。的大质粒则不易提取。 分子生物学讲座课件 能自主复制，是能独立复制的复制子。按质能自主复制，是能

4、独立复制的复制子。按质 粒复制的调控及其拷贝数可分两类：粒复制的调控及其拷贝数可分两类： v严紧控制（严紧控制（stringent control）型：复制常与）型：复制常与 宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞只有宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞只有 一个到十几个拷贝；一个到十几个拷贝； v松弛控制（松弛控制（relaxed control）型：复制和宿主）型：复制和宿主 不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。 分子生物学讲座课件 质粒对宿主生存并不是必需的。质粒对宿主生存并不是必需的。 这点不同于线粒体，线粒体这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状

5、双也是环状双 链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功 能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部 分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生 存所必需的，也不妨碍宿主的生存。某些质粒存所必需的，也不妨碍宿主的生存。某些质粒 携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下 生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药 性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉 素、氨芐表霉

6、素等的酶基因，这种质粒称为抗素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗 药性质粒，又称药性质粒，又称R质粒，带有质粒，带有R质粒的细菌就质粒的细菌就 能在相应的抗生素存在生存繁殖能在相应的抗生素存在生存繁殖 。 分子生物学讲座课件 分子生物学讲座课件 分子生物学讲座课件 分子生物学讲座课件 二、噬菌体载体二、噬菌体载体 1、结构、结构 噬菌体（噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，）是感染细菌的一类病毒， 有的噬菌体基因组较大，例入有的噬菌体基因组较大，例入噬菌和噬菌和T噬噬 菌体等；有的则较小，如菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬噬 菌体等。用感染大肠杆菌的菌体等。用感染大肠杆菌的

7、噬菌体改造噬菌体改造 成的载体应用最为广泛。成的载体应用最为广泛。 分子生物学讲座课件 分子生物学讲座课件 分子生物学讲座课件 噬菌体由头和尾构成，噬菌体由头和尾构成，DNA装在头部蛋白质装在头部蛋白质 外壳的里面。其基因组长外壳的里面。其基因组长48502bp，为线性双链，为线性双链 DNA。 噬菌体感染时，通过尾管将基因组噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入注入 大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA 进入大肠杆菌后以其两端进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末的互补单链粘末 端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖端环化成环状双链，可以两

8、种不同的方式繁殖 。 分子生物学讲座课件 溶菌性方式（溶菌性方式（lytic pathway）：在营养充足，条）：在营养充足，条 件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料， DNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、 尾和尾丝所需的各种蛋白质，尾和尾丝所需的各种蛋白质，DNA经多次复制合成经多次复制合成 许多子代许多子代DNA，于是装配成许多子代的，于是装配成许多子代的噬菌体，最噬菌体，最 后裂菌，释放出许多新的后裂菌，释放出许多新的噬菌体。噬菌体。 溶原性方式（溶原性方式（lysogenic pat

9、hway）：进入细菌的）：进入细菌的 DNA可整合可整合(integrate）入细菌的染色质）入细菌的染色质DNA中，随中，随 细菌染色体细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜复制，传给细菌后代，这个稳定潜 伏在细菌染色质伏在细菌染色质DNA中的中的DNA称为原噬菌体称为原噬菌体 (prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌 (lysogen)。DNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿的整合是可逆的，原噬菌体可从宿 主主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。中切出，进入溶菌性方式的繁殖。 分子生物学讲座课件 分子生物学讲座课件 2、基因组、基因组 噬菌体整

10、个基因组可分为三个部分：噬菌体整个基因组可分为三个部分： 左臂：长约左臂：长约20kb，编码构成头部、尾部、尾丝对，编码构成头部、尾部、尾丝对 组装完整噬菌体所需要的蛋白质。组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 中段：长约中段：长约20kb，是，是DNA整合和切出，溶原生长整合和切出，溶原生长 所需的序列。所需的序列。 右臂：长约右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生，是调控区，控制溶菌和溶原生 长最重要的调控基因和序列、以及长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均复制起始均 在这区域内。在这区域内。 左右臂是必需的，中段是非必需的左右臂是必需的，中段是非必需的 。在中段插入外。在中段

11、插入外 源基因不影响它的增殖，这是作为载体的基础。源基因不影响它的增殖，这是作为载体的基础。 分子生物学讲座课件 3、应用、应用 作为载体，但天然不行，需要改造作为载体，但天然不行，需要改造 分子生物学讲座课件 一般地，基因工程操作可以分为四个步骤一般地，基因工程操作可以分为四个步骤 目的基因的获得目的基因的获得 目的基因和载体连接目的基因和载体连接 目的基因的转化目的基因的转化 目的基因的表达目的基因的表达 第三节第三节 目的基因的获取目的基因的获取 分子生物学讲座课件 1、目的基因的概念、目的基因的概念 符合人们要求的符合人们要求的DNA片段，被称为目的基因。片段，被称为目的基因。 筛选文

12、库筛选文库 PCR扩增扩增 化学合成化学合成 2、得到目的基因的主要方法、得到目的基因的主要方法 分子生物学讲座课件 （1）基因组）基因组DNA文库文库 从细胞中提取出全部从细胞中提取出全部DNA，用物理方法（超声波，用物理方法（超声波 等）或酶法（内切酶不完全酶解）将等）或酶法（内切酶不完全酶解）将DNA降解成降解成 大小不等的片段，然后将这些片段与适当的载体大小不等的片段，然后将这些片段与适当的载体 连接，转入受体细胞，这样每一个细胞接受了含连接，转入受体细胞，这样每一个细胞接受了含 有一个基因组有一个基因组DNA片段与载体连接的重组片段与载体连接的重组DNA分分 子，而且可以繁殖扩增，许

13、多细胞一起组成一个子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个 含有基因组各含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基片段克隆的集合体，就称为基 因组因组DNA文库（文库（genomic DNA library）。如果这）。如果这 个文库足够大，能包含该生物基因组个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的全部的 序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文 库中钓取该生物的全部基因或库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。序列。 分子生物学讲座课件 基因组基因组DNA酶切酶切 分子生物学讲座课件 分子生物学讲座课件 （2）cDNA文库文库 提出细胞的全部

14、提出细胞的全部mRNA，在体外反转录成，在体外反转录成 cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体），与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体） 连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA， 并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信信 息的息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的克隆集合称为该组织细胞的cDNA文文 库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只 有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同 分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不分化时期的细胞

15、其基因表达的种类和强度也不 尽相同，所以尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。文库具有组织细胞特异性。 分子生物学讲座课件 cDNA文库显然比基因组文库显然比基因组DNA文库小得多，文库小得多， 能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达 的基因。但对真核细胞来说，从基因组的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA 文库获得的基因与从文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，文库获得的不同， 基因组基因组DNA文库所含的是带有含子和外显子文库所含的是带有含子和外显子 的基因组基因，而从的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已文库中获得的是已 经过剪接、去

16、除了内含子的经过剪接、去除了内含子的cDNA。 分子生物学讲座课件 （3）聚合酶链式反应（）聚合酶链式反应（PCR） 如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地 用聚合酶链式反应（用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR），从基因组），从基因组DNA或或cDNA中获得目的基因，中获得目的基因， 可不必要经过复杂的可不必要经过复杂的DNA文库构建过程。文库构建过程。 PCR反应系统包括：反应系统包括： 含有目的基因的含有目的基因的DNA模板模板 对热稳定的对热稳定的DNA聚合酶聚合酶 一对寡核苷酸引物一对寡核苷酸引物 4

17、种三磷酸脱氧核苷种三磷酸脱氧核苷 保证聚合酶催化反应的缓冲液保证聚合酶催化反应的缓冲液 分子生物学讲座课件 （4）人工化学合成）人工化学合成 现在计算机控制的全自动核酸合成仪已被广泛现在计算机控制的全自动核酸合成仪已被广泛 应用，按人们设计好的序列一次合成应用，按人们设计好的序列一次合成100- 200bp长的长的DNA片段已不成问题。但随意合成片段已不成问题。但随意合成 的的DNA绝大多数肯定不具有生物功能或无法知绝大多数肯定不具有生物功能或无法知 道它会有什么功能的，因而只能模仿自然界生道它会有什么功能的，因而只能模仿自然界生 物中已知的基因序列来合成，而化学合成这样物中已知的基因序列来合

18、成，而化学合成这样 长的基因长的基因DNA序列，其价格远高于用序列，其价格远高于用PCR法法 获得基因，所以目前很少全部用化学方法去合获得基因，所以目前很少全部用化学方法去合 成基因。但人工设计化学合成核酸片段作为引成基因。但人工设计化学合成核酸片段作为引 物、接头等已经成为分子生物学和基因工程中物、接头等已经成为分子生物学和基因工程中 必不可少而且十分重要的手段必不可少而且十分重要的手段。 分子生物学讲座课件 第四节第四节 目的基因和载体的连接目的基因和载体的连接 将目的基因或序列插入载体，主要靠将目的基因或序列插入载体，主要靠DNA连连 接酶。有以下主要的方式。接酶。有以下主要的方式。 一

19、、粘性末端连接一、粘性末端连接 如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核 酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端， 在降低温度退火时，能重新互补结合，在在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA 连接酶催化下，目的序列就与载体连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连链相连 接。接。 分子生物学讲座课件 分子生物学讲座课件 不同的限制性内切酶切，如果产生的不同的限制性内切酶切，如果产生的DNA的粘的粘 末端相同（同尾酶），也可用此法连接。末端相同（同尾酶），也可用此法连接。 如果在连接的两个如果在连接的两个

20、DNA片段没有能互补的粘性片段没有能互补的粘性 末端，可用末端核苷酸转移酶催化脱氧单核苷酸末端，可用末端核苷酸转移酶催化脱氧单核苷酸 添加添加DNA的的3末端，例如一股末端，例如一股DNA3端加上端加上polyG， 另一股另一股DNA3端加上端加上polyC，人工在，人工在DNA两端做出两端做出 能互补的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能连接，能互补的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能连接， 称为同聚物加尾法。称为同聚物加尾法。 对平末端的对平末端的DNA，可先连上人工设计合成的脱，可先连上人工设计合成的脱 氧寡核苷酸双链接头，使氧寡核苷酸双链接头，使DNA末端产生新的限制末端产生新的限制 内切酶位点

21、，经内切酶割后，即可按粘性末端相内切酶位点，经内切酶割后，即可按粘性末端相 连。连。 分子生物学讲座课件 GGGGG CCCCC 5 53 3 同聚物加尾法同聚物加尾法 分子生物学讲座课件 二、平末端连接二、平末端连接 T4 DNA连接酶能催化连接酶能催化DNA平末端的连平末端的连 接。如果目的序列和载体上没有相同的接。如果目的序列和载体上没有相同的 限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的 限制性内切酶切割后的粘性末端不能互限制性内切酶切割后的粘性末端不能互 补结合，则可用适当的酶将补结合，则可用适当的酶将DNA突出的突出的 末端削平或补齐成平末端，再用末端削平或

22、补齐成平末端，再用T4 DNA 连接酶连接，但平末端连接要比粘性末连接酶连接，但平末端连接要比粘性末 端连接的效率低得多。端连接的效率低得多。 分子生物学讲座课件 第五节第五节 目的基因导入细胞目的基因导入细胞 目的基因序列与载体连接后，要导入细目的基因序列与载体连接后，要导入细 胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能 获得重组获得重组DNA分子克隆，不同的载体在分子克隆，不同的载体在 不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方 法也不相同。法也不相同。 一、原核细胞一、原核细胞 分子生物学讲座课件 1、热激和电激、热激和电激 由于外源由

23、于外源DNA的进入而使细胞遗传特性改变称的进入而使细胞遗传特性改变称 为转化。为转化。1943年年Avery等就发现肺炎双球菌转化等就发现肺炎双球菌转化 现象。现象。 DNA自然进入细胞的效率很低，在基因工程中自然进入细胞的效率很低，在基因工程中 可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容 易接受外界易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源，称为感受态细胞，再与外源 DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌 经冰冷经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加的处理，就成为感受态细菌，当加 入重组质粒并突然由入重

24、组质粒并突然由4转入转入42作短时间处理，作短时间处理， 质粒质粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作 用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔 转化法。转化法。 分子生物学讲座课件 2、感染、感染 噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖 就是感染（就是感染（infection）。用经人工改造的噬菌体）。用经人工改造的噬菌体 活病毒作载体，以其活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在与目的序列重组后，在 体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将

25、重组DNA包装包装 成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进 入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。 3、转染、转染 重组的噬菌体重组的噬菌体DNA也可象质粒也可象质粒DNA的方式进入的方式进入 宿主菌，即宿主菌先经过宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理，电穿孔等处理 成感受态细菌再接受成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬，进入感受态细菌的噬 菌体菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转可以同样复制和繁殖，这种方式称为转 染。染。 分子生物学讲座课件 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪

26、法基因枪法 其他方法其他方法 二、真核细胞二、真核细胞 分子生物学讲座课件 根癌农杆菌（根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 发根农杆菌发根农杆菌(A. rhizogenes) 1、农杆菌转化、农杆菌转化 分子生物学讲座课件 根癌农杆菌浸染根癌农杆菌浸染 分子生物学讲座课件 发根农杆菌浸染发根农杆菌浸染 分子生物学讲座课件 1974年年Zaenen等研究发现，根癌农杆菌中存在一个等研究发现，根癌农杆菌中存在一个 或几个大的质粒，这些质粒是诱导植物产生肿瘤所或几个大的质粒，这些质粒是诱导植物产生肿瘤所 必须的，并称之为必须的，并称之为Ti质粒（质粒（tumour in

27、ducing plasmid）。根癌农杆菌的）。根癌农杆菌的Ti为质粒，发根农杆菌的为质粒，发根农杆菌的 为为Ri质粒。质粒。1977年，用限制性内切酶的方法证实植年，用限制性内切酶的方法证实植 物肿瘤组织中存在一段外来的物肿瘤组织中存在一段外来的DNA，是整合进植物，是整合进植物 染色体的根癌农杆菌染色体的根癌农杆菌Ti质粒的一个片段，称为转移质粒的一个片段，称为转移 DNA（transferred DNA），简称），简称T-DNA。当植物。当植物 受伤时受伤时T-DNA会转入并整合到植物的基因组中，然会转入并整合到植物的基因组中，然 后借助植物的转录和翻译系统进行表达后借助植物的转录和翻译

28、系统进行表达。 根癌农杆菌介导的基本方法根癌农杆菌介导的基本方法 分子生物学讲座课件 农杆菌示意图农杆菌示意图 分子生物学讲座课件 T-DNA 右边界 左边界 Vir 区 Ti plasmid 目的基因 分子生物学讲座课件 细胞核，示核细胞核，示核 仁和核孔仁和核孔 农杆菌附着农杆菌附着 在细胞壁上在细胞壁上 分子生物学讲座课件 T-DNA转移的过程示意图转移的过程示意图 分子生物学讲座课件 优点优点 单拷贝单拷贝 插入片段大插入片段大 表达高效表达高效 不需要贵重仪器不需要贵重仪器 农杆菌转化特点农杆菌转化特点 缺点缺点 基因型依赖基因型依赖 愈伤组织褐化坏死愈伤组织褐化坏死 单子叶不敏感单

29、子叶不敏感 抑菌比较困难抑菌比较困难 分子生物学讲座课件 PDS 1000/He 2 2、基因枪法、基因枪法 分子生物学讲座课件 基因枪原理基因枪原理 分子生物学讲座课件 手持式基因枪手持式基因枪 分子生物学讲座课件 基因枪转化特点基因枪转化特点 优点优点 操作简单操作简单 快速高效快速高效 处理样品多处理样品多 不依赖基因型不依赖基因型 缺点缺点 费用高费用高 基因沉默基因沉默 多拷贝多拷贝 分子生物学讲座课件 3 3、其他方法、其他方法 花粉管通道法花粉管通道法 原生质体转化原生质体转化 超声波法、超声波法、 电激法、电激法、 激光转化法等激光转化法等 分子生物学讲座课件 第六节第六节 含目的基因克隆的筛选与鉴定含目的基因克隆的筛选与鉴定 目的序列与载体目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导正确连接的效率、重组导 入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长 繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一 个载体只携带某一