《蛋白酶的测定方法》

1、1 响应面法优化蛋白酶生产工艺响应面法优化蛋白酶生产工艺 （下）（下） 2 实验内容实验内容 1、干物质失重的测定、干物质失重的测定 2、蛋白酶活力的测定、蛋白酶活力的测定 3、数据分析与建模、数据分析与建模 4、响应曲面作图、响应曲面作图 5、整改方案分析、整改方案分析 3 一、干物质失重的测定 干重失重发酵前干重发酵后干重干重失重发酵前干重发酵后干重 4 二、蛋白酶活力分析二、蛋白酶活力分析 5 1、 原理原理 （1 1）、福林试剂在）、福林试剂在碱性碱性情况下极不稳定，可被情况下极不稳定，可被酚类酚类化合物还化合物还 原而呈蓝色反应。原而呈蓝色反应。 （2 2）、蛋白质分子中含有具有酚基

2、的氨基酸）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸( (酪氨酸、色氨酪氨酸、色氨 酸及苯丙氦酸等酸及苯丙氦酸等) )。 （3 3）、以）、以酪蛋白酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三三 氯醋酸氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产 物分开，经过滤后取物分开，经过滤后取滤液滤液。用。用碳酸钠碱化碳酸钠碱化，再加入，再加入福林试剂福林试剂 使之发色，用分光光度计测定。使之发色，用分光光度计测定。 （4 4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而

3、水 解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反 应的强弱就可推测蛋白酶的活力。应的强弱就可推测蛋白酶的活力。 7 2 2 试剂试剂 1 1 福林试剂福林试剂 于于20002000mlml磨口回流装置内加入磨口回流装置内加入钨酸钠钨酸钠( (NaNa2 2WOWO4 42H2H2 2O)100gO)100g， 钼酸钠钼酸钠( (NaMoONaMoO4 42H2H2 2O)O)25g25g，水水700700mlml，85%85%磷酸磷酸5050m1m1，浓盐酸浓盐酸 10001000mlml，文火回流文火回流1010h h加入加入硫酸锂

4、硫酸锂( (LiLi2 2SOSO4 4)150g)150g，蒸溜水蒸溜水 5050m1m1，混匀取去冷凝器，加入几滴混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴液体溴，再煮沸，再煮沸l5minl5min，以以 驱逐残溴及除去颜色，溶液应驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色呈黄色而非绿色。若溶液仍有。若溶液仍有 绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至 10001000mlml。过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2 2倍蒸馏倍蒸馏 水稀释水稀释，即成稀释的福林试剂。，即成稀释的福林试剂。 2 2、0.40.

5、4mol/Lmol/L三氯醋酸三氯醋酸( (TCA)TCA)溶液溶液 称取三氯醋酸称取三氯醋酸65.465.4g g，定容至定容至10001000mlml。 3 3、0.4mol/L0.4mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠称取无水碳酸钠( (NaNa2 2COCO3 3)42.4g)42.4g，定容至定容至10001000m1m1。 4 4、0.05mol/L pH2.5 0.05mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液乳酸钠缓冲液 A A液：液：称取称取10.610.6g80-90%g80-90%乳酸加蒸馏水定容至乳酸加蒸馏水定容至10001000mlml。 B B液：

6、液：称取称取1616克克70%70%乳酸钠加蒸馏水定容至乳酸钠加蒸馏水定容至10001000mlml。 取取A A液液1616mlml与与B B液液1 1mlml稀释稀释1 1倍即成倍即成0.050.05mol/L pH2.5 mol/L pH2.5 乳酸乳酸 - -乳酸钠缓冲液。乳酸钠缓冲液。 5 5、2%2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 称取干酪素称取干酪素2 2g g加入加入0.10.1mol/Lmol/L氢氧化钠氢氧化钠2020mlml在水浴中加在水浴中加 热使溶解热使溶解( (必要时用小火加热煮沸必要时用小火加热煮沸) )，然后用，然后用pH2.5pH2.5乳酸乳酸- -乳乳 酸钠缓冲液定容

7、至酸钠缓冲液定容至10001000mlml即成。即成。 配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖 细菌，引起变质。细菌，引起变质。 配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1212滴酒滴酒 精消泡。精消泡。33503350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸 2323滴湿润。滴湿润。 6 6、100100g/m1g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液 精确称取在精确称取在l05烘箱中烘至恒重的酪氨酸烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步逐步 加入加入0.1mol/L盐酸盐酸(

8、HCl)使溶解，加蒸溜水定容至使溶解，加蒸溜水定容至100m1， 其浓度为其浓度为1000g/m1。 再吸取此液再吸取此液10ml以蒸馏水定容至以蒸馏水定容至100ml即配成即配成 100g/m1酪氨酸镕液酪氨酸镕液 此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁 殖细菌而变质。殖细菌而变质。 3 3 操作步骤操作步骤 3.1 标准曲线的绘制标准曲线的绘制 （1 1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 (2)(2)测定步骤测定步骤 另取另取6 6支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨支试管按上表编号分别吸取不同浓

9、度的酪氨 酸酸1 1mlml，各加入各加入0.40.4mo1/Lmo1/L碳酸钠碳酸钠5 5m1m1，再加入已稀释的福再加入已稀释的福 林试剂林试剂1 1m1m1。 摇匀置于水浴锅中，摇匀置于水浴锅中，4040保温发色保温发色2020minmin，在波长在波长 660660nmnm处测定吸光度。一般测处测定吸光度。一般测3 3次，取平均值次，取平均值 以吸光度为纵座标，酪氨酸的浓度为横座标，绘制以吸光度为纵座标，酪氨酸的浓度为横座标，绘制 成标准曲线。成标准曲线。 准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2 2g g，用用10102020mlml蒸蒸 馏水，馏水，3030浸提浸

10、提半小时，用滤纸半小时，用滤纸过滤过滤。将滤液稀释一定。将滤液稀释一定 倍数倍数( (使其测定光密度在使其测定光密度在0.20.20.40.4范围内为宜范围内为宜) )。 3.2 3.2 酶液的制备酶液的制备 取四支试管，分别加入取四支试管，分别加入1 1mlml稀释酶液，其中一支为空白稀释酶液，其中一支为空白 管，三支为平行试验管，置入管，三支为平行试验管，置入4040水浴中预热水浴中预热3 35 5minmin。 在三支平行试验管中分别加入在三支平行试验管中分别加入1 1ml 2% ml 2% 酪蛋白溶液，准酪蛋白溶液，准 确计时保温确计时保温1010minmin。立即加入立即加入2 2m

11、l 0.4Mml 0.4M三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液， l5minl5min后用滤纸过滤。分别吸取后用滤纸过滤。分别吸取1 1mlml清液，加清液，加5 5ml 0.4Mml 0.4M碳酸碳酸 钠溶液，最后加入钠溶液，最后加入1 1mlml福林福林- -酚试剂，摇匀，于酚试剂，摇匀，于4040水浴中水浴中 显色显色2020minmin。 空白管中先加入空白管中先加入2 2ml 0.4Mml 0.4M三氯乙酸溶液，再加三氯乙酸溶液，再加l ml 2%l ml 2% 酪蛋白溶液，酪蛋白溶液，1515minmin后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管 相同。相同。 以空

12、白管为对照，在以空白管为对照，在680纳米纳米波长下测波长下测光密度光密度，取其平，取其平 均值。均值。 3.3 3.3 测定测定 蛋白酶活力单位定义：蛋白酶活力单位定义：在在4040，pH2.5pH2.5下，每分钟水解下，每分钟水解 酪蛋白释放酪蛋白释放1 1微克酪氨酸的酶量定义为微克酪氨酸的酶量定义为1 1个蛋白酶单位。个蛋白酶单位。 式中：式中： K K：标准曲线中标准曲线中ODOD值为值为1 1所相当的酪氨酸的微克数；所相当的酪氨酸的微克数； OD OD：平行试验管的平均光密度；平行试验管的平均光密度； 4 4：试管中反应液总体积：试管中反应液总体积( (毫升毫升) )； 10 10：

13、反应：反应1010分钟；分钟； N N：稀释倍数；稀释倍数；W W：曲的称取量曲的称取量( (克克) ) 4 4 计算计算 （1 1）对于同一台分光光度计与同一批福林）对于同一台分光光度计与同一批福林- -酚试剂，酚试剂， 其工作曲线其工作曲线K K值可以沿用，当另配福林值可以沿用，当另配福林- -酚试剂时，工作曲酚试剂时，工作曲 线应重作。线应重作。 （2 2）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时， 其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白 的生产厂。的生产厂。 5 5 说明说明 三、三、数据分析与建模数据分析与建模 使用使用DESIGN EXPERT 7.1 软件软件 1、建立数学模型、建立数学模型 2、模型显著性检验、模型显著性检验 3、解方程，求出最佳发酵条件、解方程，求出最佳发酵条件 4、求出模型所预测的最高产量。、求出模型所预测的最高产量。 四、响应曲面作图四、响应曲面作图 D esign-E xpert?S oftware R1 55.3 28.8 X 1 = A : A X 2 = B : B A c tual Fac tor C