血清清蛋白的分离纯化和鉴定

1、 方法一：方法一：3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性二硝基水杨酸测淀粉酶活性 一、实验目的一、实验目的 1. 掌握用掌握用3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活二硝基水杨酸测淀粉酶活 性性的方法的方法 2. 熟悉熟悉3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性二硝基水杨酸测淀粉酶活性 的原理的原理 二、基本原理二、基本原理 1、测量依据、测量依据 淀粉酶催化淀粉分子中-1,4糖苷键水解, 产生还原糖淀粉酶活力的大小与产生的还 原糖的量成正比，可以单位体积样品在一 定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。 2、相关反应、相关反应: ：淀粉酶产生的这些还原糖能使3， 5二硝基水杨酸还原，生成棕红 色的3氨基5硝基水杨酸。具

2、 体反应式为： 三、操作步骤三、操作步骤 实验设备实验设备 试管，滴管，容量瓶，分光光度计，酸 度计，电热恒温水浴锅，电磁炉。 1. 实验设备：实验设备： 三、操作步骤三、操作步骤 （1）0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液 ：A液：称取柠檬酸20.01g，定容至 1000ml；B液：称取柠檬酸钠29.41g， 定容至1000ml；取A液55ml与B液145ml 混匀。 （2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于 100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液 ； 实验试剂及其配制实验试剂及其配制： （3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取3,5- 二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6

3、g、酒石酸钾钠 30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2 进入； 麦芽糖标准溶液：取麦芽糖0.1g溶于100ml 水中； （5）pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾 6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化 钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml 即得。 （6）0.4mol/L的NaOH溶液； （7）淀粉酶溶液 三、操作步骤三、操作步骤 实验步骤实验步骤 淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定 (1)取试管： 取试管4支,2支为对照管,2支为 测定管。 (2) 装溶液：在2支对照管中分别加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (3) 加试剂：在4支试管中各加入1m

4、l pH5.6 的柠檬酸缓冲液和淀粉酶溶液lml。 基本操作基本操作 (4) 保温：将4支试管置另一个37 恒温水浴 中保温15min ,再向各管分别加入37下预 热的1淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入37 恒温水浴保温5min。取出后向测定管迅速加 入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备 测糖。 麦芽糖的测定麦芽糖的测定 ： (1)标准曲线的制作: 取试管7支,编号.分别 加入麦芽糖标准液（1mg/ml ）0,0.2,0.6, 1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加 蒸馏水使溶液达2.0ml,再各加3,5一二硝基 水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热10min

5、， 取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用 分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸 光度，以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量 （ mg ）为横坐标，绘制标准曲线 （操作的关键环节操作的关键环节） 样品的测定: 取酶作用后的各管溶液 2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度 试管中,各加入2m1 3,5-二硝基水杨酸 试剂。置沸水浴中加热10min .取出冷 却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分 光光度计在520nm波长下进行比色,记 录吸光度，根据样品比色吸光度平均 值,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后 进行结果计算。 计算公式：计算公式： 相关实验 一、实验拓展一、实验拓展 方法二：

6、方法二：碘碘-淀粉测定淀粉酶活性淀粉测定淀粉酶活性 一、实验目的一、实验目的 1. 掌握测定淀粉酶活性的原理掌握测定淀粉酶活性的原理 2. 熟悉测定淀粉酶活性操作方法熟悉测定淀粉酶活性操作方法 二、基本原理二、基本原理 原理：淀粉酶催化淀粉分子中-1,4糖苷键水 解,产生葡萄糖、麦芽糖及糊精。利用已知浓 度的淀粉溶液作为底物，加入一定量的淀粉 酶，在适应条件下淀粉酶将部分淀粉水解。 在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未 被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的 深浅与淀粉的浓度成正相关,用分光光度计法 测出反应后淀粉的浓度，从而推算出单位体 积样品在一定时间内消耗淀粉的量。 五、讨论五、讨论

7、依据血清电泳的结果作为阳依据血清电泳的结果作为阳 性对照，判断盐析过滤液中性对照，判断盐析过滤液中 有无清蛋白。有无清蛋白。 分析所获得的清蛋白纯度分析所获得的清蛋白纯度 分析有无分离获得清蛋白分析有无分离获得清蛋白 根据层析液样品电泳结果中根据层析液样品电泳结果中 杂蛋白条带出现的情况，判杂蛋白条带出现的情况，判 断分离的清蛋白纯度。断分离的清蛋白纯度。 六、结论六、结论 (4) 保温：将4支试管置另一个37 恒温水浴 中保温15min ,再向各管分别加入37下预 热的1淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入37 恒温水浴保温5min。取出后向测定管迅速加 入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备 测糖。 麦芽糖的测定麦芽糖的测定 ： (1)标准曲线的制作: 取试管7支,编号.分别 加入麦芽糖标准液（1mg/ml ）0,0.2,0.6, 1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加 蒸馏水使溶液达2.0ml,再各加3,5一二硝基 水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热10min， 取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用 分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸 光度，以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含