生化实验三果蔬中蛋白质含量测定

1、综合实验一： 果蔬成分的生化分析果蔬成分的生化分析 实验一实验一 果蔬中维生素果蔬中维生素C的定量测定（的定量测定（4学时）学时） 实验二实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时）学时） 实验三实验三 果蔬中蛋白质含量的测定（果蔬中蛋白质含量的测定（4学时）学时） 实验四实验四 果蔬中过氧化物酶分析（果蔬中过氧化物酶分析（12学时）学时） 实验材料：实验材料： 冬枣柚子冬枣柚子14组组 梨（梨（2个品种）个品种）58组组 盘菜萝卜盘菜萝卜 912组组 果蔬中蛋白质含量的测定果蔬中蛋白质含量的测定 （考马斯亮蓝法）（考马斯亮蓝法） 1、掌握蛋白质测定的方法和技术

2、。、掌握蛋白质测定的方法和技术。 2、了解果蔬中蛋白质的含量。、了解果蔬中蛋白质的含量。 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，在酸性游离状态下呈棕红色， 最大光吸收在最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝，当它与蛋白质结合后变为蓝 色，最大光吸收在色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复染料复 合物在波长为合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正处的光吸收与蛋白质含量成正 比，通过测定比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结处光吸收的增加量可知与其结 合蛋白质的量。合蛋白质的量。 1、可

3、见光分光光度计、可见光分光光度计 2、旋涡混合器、旋涡混合器 3、试管、试管16支支 1、标准蛋白质溶液、标准蛋白质溶液牛血清清蛋白牛血清清蛋白(bsa)： 配制成配制成1.0mg/ /mL和和0.1mg/ /mL的标准蛋白质溶液。的标准蛋白质溶液。 2、考马斯亮兰、考马斯亮兰G-250染料试剂：染料试剂： 称称100mg考马斯亮兰考马斯亮兰G-250，溶于，溶于50mL 95%的乙醇的乙醇 后，再加入后，再加入120mL 85%的磷酸，用水稀释至的磷酸，用水稀释至1L。 3、0.05mol/ /L Tris-HCl缓冲液（缓冲液（pH6.8） 4、各种果蔬、各种果蔬 1、标准曲线绘制：、标准

4、曲线绘制： 取取6支试管，按下表加入各试剂。支试管，按下表加入各试剂。 管号管号 试剂试剂 012345 100 g / /mL牛血清白蛋牛血清白蛋 白溶液白溶液mL 0 0.20.40.60.81.0 蒸馏水蒸馏水mL 1.00.80.60.40.20 考马斯亮蓝液考马斯亮蓝液mL 5.05.05.05.05.05.0 加入考马斯亮蓝加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇蛋白试剂后，摇 匀，放置匀，放置2min后，在后，在595nm波长下比色测定，波长下比色测定， 记录记录A595。 以各管相应标准蛋白质含量（以各管相应标准蛋白质含量（ g）为横）为横 坐标、坐标、A595为纵坐标，绘制标准

5、曲线。为纵坐标，绘制标准曲线。 2、样品制备样品制备： 称取称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内， 加入加入1mL H 2O或 或0.05mol/ /L Tris-HCl缓冲液缓冲液 （pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或水或 缓冲液缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部 转入离心管，转入离心管，3500rpm离心离心1520min，其上清液，其上清液 即为蛋白质提取液，供分析用。即为蛋白质提取液，供分析用。 （注：盘菜，萝卜稀释至（注：盘菜，萝卜稀释至10mL） 3、样品测定样品

6、测定： 试管中加自制蛋白质样品试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入，再加入 5.0mL考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置试剂，摇匀，放置5min后，后， 在在595nm波长下比色，记录波长下比色，记录A595。 根据所测根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。从标准曲线上查得蛋白质含量。 、如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的、如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的 520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色内测定光吸收，因为在这段时间内颜色 是最稳定的。比色反应需在是最稳定的。比色反应需在1h内完成。内完成。 、测定中，蛋白、测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附

7、于染料复合物会有少部分吸附于 比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽 略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）， 可用塑料或玻璃比色皿，测定完后可用可用塑料或玻璃比色皿，测定完后可用95%的乙醇的乙醇 将蓝色的比色杯洗干净。将蓝色的比色杯洗干净。 果蔬中蛋白质含量的测定果蔬中蛋白质含量的测定 （Folin-酚试剂法酚试剂法 ） 1、掌握蛋白质测定的方法和技术。、掌握蛋白质测定的方法和技术。 2、了解果蔬中蛋白质的含量。、了解果蔬中蛋白质的含量。 。 本方法最大的优点是灵敏度高，比双缩脲法本方法最大的

8、优点是灵敏度高，比双缩脲法 灵敏灵敏100倍，较紫外分光光度法灵敏倍，较紫外分光光度法灵敏1020倍。倍。 1、分光光度计、分光光度计 2、电热恒温水浴箱、电热恒温水浴箱 3、试管、试管 15150mm 4、刻度吸管、刻度吸管 0.5mL、1mL、5mL 5、试管架、试管架 6、容量瓶、容量瓶 500mL 7、坐标纸、坐标纸 1、甲试剂：、甲试剂： ：2g无水碳酸钠，加入无水碳酸钠，加入0.1mol/ /L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 100mL混匀；混匀； ：称取：称取CuSO45H2O 0.5g，加入，加入1%（35mmol/ /L） 酒石酸钾钠溶液酒石酸钾钠溶液100mL，混匀。，混匀。 使

9、用前将与按使用前将与按50:1混合即成碱性硫酸铜溶混合即成碱性硫酸铜溶 液。（混合后，试剂只能使用一天，但碱性溶液和液。（混合后，试剂只能使用一天，但碱性溶液和 0.5% CuSO45H2O溶液可分别长期保存）溶液可分别长期保存） 2、乙试剂：、乙试剂： 在在2L磨口回流装置中加入磨口回流装置中加入100g钨酸钠，钨酸钠，25g钼钼 酸钠及酸钠及700mL蒸馏水，再加入蒸馏水，再加入50mL 85%磷酸及磷酸及 100mL浓浓HCl，充分混合后用小火回流，充分混合后用小火回流10小时。回小时。回 流完毕冷却后，加入流完毕冷却后，加入150g锂，锂，50mL蒸馏水及液体蒸馏水及液体 溴数滴，摇匀

10、后再开口沸腾溴数滴，摇匀后再开口沸腾15分钟，以驱逐过量溴。分钟，以驱逐过量溴。 溶液冷却后稀释至溶液冷却后稀释至1000mL，溶液呈透明淡黄色，溶液呈透明淡黄色， 置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存。置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存。 使用前用标准使用前用标准NaOH溶液标定，以酚酞为指示溶液标定，以酚酞为指示 剂，标定其酸度为剂，标定其酸度为1 mol/ /L，此为乙试剂应用液，此为乙试剂应用液， 置冰箱中可长期保存。置冰箱中可长期保存。 3、牛血清白蛋白标准液（、牛血清白蛋白标准液（200 g g/ /mL）：）： 准确称取牛血清白蛋白粉末准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用，用0.1

11、 mol/ /L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到溶液润湿溶解，加蒸馏水到250mL。 4、0.05mol/ /L Tris-HCl缓冲液（缓冲液（pH6.8） 5、各种果蔬、各种果蔬 1、标准曲线绘制：、标准曲线绘制： 取取7支试管，按下表加入各试剂。支试管，按下表加入各试剂。 试剂试剂0123456 牛血清牛血清 白蛋白白蛋白 标准液标准液 0.0mL 0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL 蒸馏水蒸馏水1.0mL 0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL 甲试剂甲试剂5.0mL 5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL 混匀，

12、于混匀，于2025（或室温下）放置（或室温下）放置10min 乙试剂乙试剂0.5mL 0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL 迅速混匀，迅速混匀，2025（或室温下）放置（或室温下）放置 30min，用分光光度计，在波长，用分光光度计，在波长500nm下，下， 以以“0”号管调零，测定各管吸光度。号管调零，测定各管吸光度。 以各管吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓以各管吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓 度为横坐标，绘制标准曲线。度为横坐标，绘制标准曲线。 2、样品制备样品制备： 称取称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内， 加入加入1mL H 2O或

13、 或0.05mol/ /L Tris-HCl缓冲液缓冲液 （pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或水或 缓冲液缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部 转入离心管，转入离心管，3500rpm离心离心1520min，其上清液，其上清液 即为蛋白质提取液，供分析用。即为蛋白质提取液，供分析用。 （注：盘菜，萝卜稀释至（注：盘菜，萝卜稀释至10mL） 3、样品测定样品测定： 取取2只试管编号，按下表加入试剂：只试管编号，按下表加入试剂： 试剂试剂空白管空白管测定管测定管 蛋白质提取液蛋白质提取液 - -1.0mL 蒸馏水蒸馏

14、水1.0mL- - 甲试剂甲试剂5.0mL5.0mL 混匀，于混匀，于2025（或室温下）放置（或室温下）放置10min 乙试剂乙试剂0.5mL0.5mL 迅速混匀，迅速混匀，2025（或室温下）放置（或室温下）放置 30min，用分光光度计，在波长，用分光光度计，在波长500nm下，以下，以 “0”号管调零，测定各管吸光度号管调零，测定各管吸光度 根据测定管吸光度，在标准曲线上查出根据测定管吸光度，在标准曲线上查出 对应的标准蛋白质的浓度，再乘以稀释倍数，对应的标准蛋白质的浓度，再乘以稀释倍数， 即为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数。即为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数。 1、Folin-酚试剂在酸性条

15、件下较稳定，在加入到碱酚试剂在酸性条件下较稳定，在加入到碱 性的铜离子性的铜离子-蛋白质溶液中时（蛋白质溶液中时（pH约约10），必须立），必须立 即混匀，以便在磷钼酸、磷钨酸试剂破坏之前，即即混匀，以便在磷钼酸、磷钨酸试剂破坏之前，即 发生还原反应。发生还原反应。 2、本法受多种因素干扰，凡对双缩脲反应起干扰、本法受多种因素干扰，凡对双缩脲反应起干扰 作用的基团以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲液均作用的基团以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲液均 可干扰可干扰Folin-酚反应。酚反应。 3、所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸也会干扰、所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸也会干扰 Folin-酚反应。在测

16、试时应排除干扰因素或作空白酚反应。在测试时应排除干扰因素或作空白 试验。浓度较低的尿素、胍、三氯乙酸、乙醚等试验。浓度较低的尿素、胍、三氯乙酸、乙醚等 （各（各0.5%左右）、硫酸钠、硝酸钠（各左右）、硫酸钠、硝酸钠（各1%）、乙）、乙 醇（醇（5%）等溶液对显色无影响。但含量高时，必）等溶液对显色无影响。但含量高时，必 须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只需加浓碳酸钠须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只需加浓碳酸钠- 氢氧化钠溶液即可。若样品酸度很高，显色后色浅，氢氧化钠溶液即可。若样品酸度很高，显色后色浅， 则必须提高碳酸钠则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度氢氧化钠溶液的浓度12倍。倍。 另外此法也

17、适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。另外此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，在酸性游离状态下呈棕红色， 最大光吸收在最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝，当它与蛋白质结合后变为蓝 色，最大光吸收在色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复染料复 合物在波长为合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正处的光吸收与蛋白质含量成正 比，通过测定比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结处光吸收的增加量可知与其结 合蛋白质的量。合蛋白质的量。 1、可见光分光光度计、可见光分光光度计 2、旋涡混合器、旋涡混合器 3、试管、试管16支支 1、标准蛋白质溶液、标准蛋白质溶液牛血清清蛋白牛血清清蛋白(bsa)： 配制成配制成1.0mg/ /mL和和0.1mg/ /mL的标准蛋白质溶液。的标准蛋白质溶液。 2、考马斯亮兰、考马斯亮兰G-250染料试剂：染料试剂： 称称100mg考马斯亮兰考马斯亮兰G-250，溶于，溶于50mL 95%的乙醇的乙醇 后，再加入后，再加入120mL 85%的磷酸，用水稀释至的磷酸，用水稀释