PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)

1、pcr常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板dna或加大模板的用量 2.更换buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.mg2

2、+浓度偏高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式pcr 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dntp、mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dntp和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增

3、产物 的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 pcr引物设计的黄金法则 （转自tiangen） 1.引物最好在模板cdna的保守区内设计。 dna序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在ncbi上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如dnaman）比对（alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区 2.引物长度一般在1530碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是1

4、8-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于taq dna 聚合酶进行反应。 3.引物gc含量在40%60%之间，tm值最好接近72。 gc 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的gc含量不能相差太大。另外，上下游引物的tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于tm值510。若按公 式tm= 4（g+c）+2（a+t）估计引物的tm值，则有效引物的tm为5580，其tm值最好接近72以使复性条件最佳。 4.引物3端要避开密码子的第3位

5、。 如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3端不能选择a，最好选择t。 引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为a时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为t时，错配的引发效率大大降低，g、c错配的引发效率介于a、t之间，所以3端最好选择t。 6. 碱基要随机分布。 引 物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（false priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其

6、3端不应超过3个连续的g 或c，因这样会使引物在gc富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3 端的互补重叠以防止引物二聚体（dimer与cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其g值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使pcr

7、反应不能正常进行。 8. 引物5 端和中间g值应该相对较高，而3 端g值较低。 g 值是指dna 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，g值越大，则双链越稳定。应当选用5 端和中间g值相对较高，而3 端g值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3 端的g 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发dna 聚合反应。（不同位置的g值可以用oligo 6软件进行分析） 9.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 引物的5 端决定着pcr产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、eu3+等；引入

8、蛋白质结合dna序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3 端开始的，不能进行任何修饰。3 端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 某 些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如rnastructure）可以预测估计 mrna的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（g）小于58.6l kj/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧gtp取代dgtp对扩增的成功是有帮助的。 11. 引物应具有特异性。 引物设计完

9、成以后，应对其进行blast检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如gc含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的pcr，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 做real time时,用于sybr green i法时的一对引物与一般pcr的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。 引物设计的要求： 1)避免重复碱基，尤其是g. 2)tm=58-60度。 3）gc=30-80%. 4)3端最后5个碱基内不能有多于2个的g或c.

10、 5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。 6)pcr扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。 7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上； 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组dna污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组dna污染的影响。 至于设计软件，primer3,primer5,primer express都应该可以的。 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备-寻找合适