山药预防骨质疏松的IGF-1靶点研究

1、山药预防骨质疏松的IGF-1靶点研究摘要 目的 观察山药对MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的影响及可能的作用机制。方法 采用不同浓度山药提取液处理细胞，MTT法检测MC3T3-E1细胞的增殖活性；磷酸苯二钠法、偶氮偶联法检测细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性；双荧光素酶检测IGF-1启动子荧光素酶报告基因重组质粒活性；Western印迹法检测IGF-1蛋白表达。结果 山药促进MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化，并增加了IGF-1的转录和表达，且具有剂量依赖性（P0.01，P0.05）。结论 山药可以促进IGF-1的转录和表达及MC3T3-E1细胞的增殖和分化，IGF-1可能是山药促成骨的靶点之一

2、。关键词 山药；MC3T3-E1；成骨；IGF-1骨质疏松症，是一种全身性骨代谢疾病，以骨量低下，骨微结构破坏、骨密度降低、骨脆性增加、易骨折为主要特征1，据世界卫生组织调查结果显示，目前全球有超过两亿人罹患此病2。随着我国死亡率下降，人口老龄化日趋严重，我国目前约有1.3亿老龄人口，骨质疏松症已成为严重影响老年人健康及生活质量的疾病3。目前骨质疏松的主要治疗药物有雌激素、双膦酸盐、降钙素、选择性雌激素受体调节剂和单克隆抗体等4。然而，这些药物可能引起浸润性乳腺癌、骨坏死、静脉血栓、皮肤和泌尿道感染等副作用，且价格昂贵5。与此同时，中药因其相对价格较低，副作用较小，近年来备受关注。山药作为中药

3、的一种，具有悠久的种植历史，山药有调节免疫、降血糖血脂、抗氧化、抗肿瘤等作用6，因其独特的药食同源性，为广大人民所接受。此前曾有山药治疗骨质疏松的报道，但其成骨机制尚不完全明确789。骨重塑是成骨与破骨之间严格的平衡，IGF-1作为骨基质中含量非常丰富的细胞因子之一，在骨形成的过程中发挥关键作用10。有研究表明，山药提取物具有类雌激素样作用，调节下丘脑-垂体-性腺轴11.而下丘脑-生长激素-IGF-1轴也受激素的调节12。基于以上，我们探究IGF-1是否是山药成骨的靶点之一，为指导山药临床治疗骨质疏松提供了重要的理论意义及实用价值。1 材料与方法1.1 细胞和试剂小鼠胚胎成骨细胞前体细胞系MC

4、3T3-E1、人胚肾上皮细胞系HEK293T购自中国科学院典型培养物保藏委员会；山药乙醇提取液购自上海源叶生物科技有限公司；DMEM、Opti-MEM购自美国Gibco公司；胎牛血清购自天津康源生物技术有限公司；胰蛋白酶、MTT、DMSO、Trixon-100购自北京鼎国生物科技有限公司；碱性磷酸酶检测试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；anti-IGF-1兔多克隆抗体、-actin鼠单克隆抗体、辣根过氧化氢酶标记羊抗兔及羊抗鼠二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；Taq DNA polymerase、DNA Marker、各种限制性内切酶均购自Takara公司；双荧光素

5、酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司；AxyPrep PCR清洁试剂盒购自美国Axygen公司；大提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。1.2 细胞培养MC3T3-E1细胞培养于10%FBS和双抗的-MEM培养基，HEK293T培养于10%FBS和双抗的DMEM培养基。培养条件均为 37C，5% CO2，当细胞达到80%汇合率时备用。1.3 细胞增殖检测 胰酶消化对数生长期MC3T3-E1 细胞，以 1104个/cm2浓度、每孔100L 接种于 96 孔培养板中，24h后换液，空白对照组加入0M山药乙醇提取物的培养基，实验组分别加入浓度为10-10M，10-9M，10-8M，10-7M，

6、10-6M的山药乙醇提取物的培养基，每种浓度各设5个复孔。再加入受试药24 h，48 h，72 h 后，每孔分别加入 5 mg/m L MTT 20 L，5%CO2，37C孵箱孵育4小时，弃培养基，每孔加入 150 L DMSO，振荡混匀至沉淀完全溶解后，于全波长酶标仪上波长490nm 处检测吸光度值（OD 值）。1.4 碱性磷酸酶活性检测 胰酶消化对数生长期MC3T3-E1 细胞，以 1104个/cm2浓度、每孔100L 接种于 96 孔培养板中，24h后换液，空白对照组加入0M山药乙醇提取物的培养基，实验组分别加入浓度为10-10M，10-9M，10-8M的山药乙醇提取物的培养基，每种浓度

7、各设5个复孔。加入受试药7天、14天后，弃培养液，每孔加入 0.2m L 的 0.2 % Triton X-100 裂解液，冰上裂解细胞 20min，各孔取 10 L 细胞裂解液，根据 BCA 蛋白定量试剂盒的说明在 562 nm 处检测各孔的吸光度值，测蛋白浓度；各孔取 30 L细胞裂解液，根据 ALP 试剂盒的说明在 520 nm 处检测各孔的吸光度值。经公式：（测定孔吸光度值-空白孔吸光度值）/（标准孔吸光度值-空白孔吸光度值）酚标准品浓度待测样本蛋白浓度，得出每孔碱性磷酸酶的含量。1.5荧光素酶报告基因活性检测 通过NCBI数据库查找IGF-I启动子序列，应用primer 5.0引物设

8、计软件设计IGF-I启动子的引物，以人类基因组为模板进行PCR，克隆人类IGF-I启动子序列（-1832bp+263bp）。将经PCR扩增得到的IGF-1p片段与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化入新鲜制备的感受态大肠杆菌DH5中，筛选阳性质粒进行培养、提取、Kpn&Hind双酶切鉴定及测序。将回收的IGF-Ip启动子片段与pGL-2载体连接,构建pGL2-IGF-Ip重组质粒。胰酶消化对数生长期的HEK293T细胞，以 1104个/cm2浓度、每孔 200 L 接种于 48 孔培养板中；37 ，5 %CO2的培养箱中培养，16小时后，将荧光素酶报告基因重组质粒与内参（Renilla

9、）荧光素酶质粒pREP7-RLuc共转染至HEK293T，继续培养24小时，各孔加入不同浓度山药乙醇提取液，使得培养基山药终浓度分别为 0M，10-10M，10-9M，10-8M。每种浓度3个复孔，药物干预24 h，弃培养基，每孔加入65lPLB裂解液，冰上裂解15分钟，分别加入两种不同荧光素酶的底物并利用Turner Designs TD20/20光度计检测其荧光素酶活性。1.6 Western印迹实验检测 胰酶消化对数生长期 MC3T3-E1 细胞，以 1104个/cm2浓度、每孔 2ml接种于 6孔培养板中；37 ，5 %CO2的培养箱中培养，16小时后换液，空白对照组加入0M山药乙醇提

10、取物的培养基，实验组分别加入浓度为10-10M，10-9M，10-8M的山药乙醇提取物的培养基，48小时后，弃培养基，RIPA裂解液(400lRIPA+ 4lPMSF)裂解组织，蛋白样品进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜,封闭液封闭(4过夜),anti-IGF-1兔多克隆抗体（1:500）-actin鼠单克隆抗体(1 1000)室温孵育2h,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1：1000)、山羊抗鼠IgG(1:500)室温孵育2h,X线片曝光,显影、定影后观察结果。1.7统计学分析 所得数据以 xs 表示，采用SPSS17.0 统计软件处理实验数据，组间比较

11、用单因素方差分析，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 山药对MC3T3-E1细胞增殖的影响 相较对照组，各浓度组山药在加药24,48和72小时时，均可促进MC3T3-E1细胞增殖，且低浓度时具有剂量依赖性，当浓度达到10-8M时，促细胞增殖效果最明显，随着浓度升高，促增值作用有所下降，见图一。后续实验我们选取10-10M，10-9M，10-8M三组浓度进行检测。2.2 山药对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响 碱性磷酸酶活性检测结果显示，在山药干预MC3T3-E1细胞7天、14天时，与对照组相比，各浓度组均有成骨分化，且呈现剂量依赖性，见图二。2.3山药对IGF-1启动子转录活性的

12、影响 PCR扩增得到IGF-1启动子目的片段，见图三A。 IGF-1p片段与pGEM-T Easy载体连接，进行Kpn单酶切及Kpn&Hind 双酶切，结果显示连接成功，见图三B。回收的IGF-Ip片段与pGL-2载体连接,构建pGL2-IGF-Ip重组质粒，Kpn单酶切及Kpn&Hind 双酶切，结果显示构建成功，见图三C。对构建的质粒进行测序，测序结果显示构建正确，见图五。荧光素酶报告基因活性检测结果显示，与对照组相比，各浓度组山药均促进了IGF-1启动子转录，并且具有剂量依赖性，见图四。2.4 山药对MC3T3-E1细胞中IGF-1表达的影响 与对照组比较，各浓度山药组IGF-1蛋白表达

13、量均上调，且具有剂量依赖性，见图五。3 讨论随着人类寿命的延长，人口老龄化，骨质疏松症及其引起的骨折越来越普遍，已成为严重的社会公共健康问题13。大量临床研究显示，常用的治疗骨质疏松西药存在巨大风险及副作用，新的治疗药物及靶点亟待开发14。在我国，成骨中药有着悠久的研究历史,但多数中医中药都围绕着“肾主骨生髓”、“在体为骨”、“肝肾同源”等理论，对于成骨靶点研究较少15。本实验结果显示, 山药提取液可以促进MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化。MTT细胞增殖实验结果表明，在给药24小时、48小时、72小时时，各浓度组山药均显著增加了成骨细胞增殖活性，24-48小时期间对成骨细胞增殖的促进作用比4

14、8-72小时显著。低浓度组山药呈现剂量依赖性，当山药浓度达到10-8M时增殖作用达到峰值，此后随着浓度增加，促增殖作用减弱。由此我们选取剂量依赖浓度组10-10M、10-9M、10-8M进行后续实验。我们应用磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶活性，结果表明各浓度组山药在作用MC3T3-E1细胞7天和14天后，均出现了明显的成骨分化，且具有剂量依赖性。 IGF-1是促进骨改建，治疗骨质疏松的关键因子之一，以IGF-1为靶点治疗骨质疏松具有重要意义。本研究选取IGF-1作为研究对象，来探讨山药成骨的可能靶点之一。我们构建IGF-1启动子荧光素酶报告基因重组质粒，并进行双荧光素酶报告基因活性检测，结果显示，

15、与对照组相比各浓度组山药均可增加IGF-1启动子转录活性，且具有剂量依赖性。Western印迹实验结果显示，山药对IGF-1蛋白表达具有促进作用，与双荧光素酶检测结果一致。综上所述，山药对MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化具有促进作用，且增加了细胞内关键的成骨因子IGF-1的转录和表达。为山药治疗骨质疏松的实验研究及临床研究提供了科学依据，但其作用机制仍需进一步探讨。1陈玉凤, 郭献山, 王林栋, 等.糖尿病合并非创伤性骨折的发生部位和危险因素J.郑州大学学报 (医学版) , 2015, 50 (1) :138-141.2、沈夏英，沈序英，邝海东，等 社区骨质疏松防治健康教育模式探讨 当代医学

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