蛋白质双向电泳、western blot原理、方法、应用

1、Presentation Title Your company information 双向电泳的实验原理 第一向：等电聚焦 第二向：SDSPAGE电泳 第一向：等电聚焦 第二向：第二向：SDSPAGESDSPAGE电泳电泳 聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联 剂N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速剂 N,N,N四甲基乙二胺（TEMED）和催化 剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交 联成三维网状的凝胶，以此凝胶为支持物 的电泳称为PAGE。 样品制备基本原则 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有 可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉

2、淀。 防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化 学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白， 从而保证待研究蛋白的可检测性。 双向电泳样品的溶解 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积 体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、 多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。 增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段 离液剂（变性剂）：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充 分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量 域。典型

3、代表是尿素和硫尿。 去垢剂（表面活性剂）：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏 水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的 去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP- 40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。 还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已 变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的 DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还 原。 起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面 活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离 子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些 蛋白质在其处于PI点时会

4、发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少 量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两 性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会 使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性， 在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解 质的pH值与之相符合。 聚焦时间的优化 要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所 需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时 间。 聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围 和胶条长度通过经验来确定。 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会 因为活性水转运而导致过多水在IPG胶

5、表面渗出 （电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产 生水平条纹以及蛋白丢失。 两维间的平衡 等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也 可于80保存数月。 但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便 于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS- PAGE电泳能顺利进行。 建议方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、 6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲 液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT 后的上述缓冲液平衡15min。如果用TBP代替DTT 则只需一步平衡。 聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测 理想显色剂的7S 安全（sa

6、fety）： 灵敏（sensitivity）： 简单（simplicity）： 特异性（specificity）： 快速（speed）： 稳定（stability）： 兼容性（synergy）： 适用于质谱的染色方法 考马斯亮兰（Bio-Safe Coomassie colloidal 250 stain） 银染（Silver Stain Plus stain） 荧光染色（SYPRO Ruby protein gel stain） 凝胶的图像处理分析 典型流程典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立： 双向电泳实验

7、流程 样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） PDQuest软件分析（Software analysis） 质谱鉴定（Protein identification） 最高电压10,000 V 1025C 温度控制 7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚 焦盘，可以各放12根胶条 可以储存1

8、0个程序，每个程 序有10步 程序可进行时时编辑 可供选配的打印机 等电聚焦的操作 1. 取出IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室 温平衡。 2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。 3. 去除预制IPG胶条上的保护层（图2） 。 4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图 3） 。 5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油。 6. 对好正、负极，盖上盖子。 7. 设置等电聚焦程序。 等电聚焦的操作 1. 取出IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室 温平衡。 2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。 3. 去除预制IPG胶条上的保护层（图2） 。 4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中

9、（图 3） 。 5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油。 6. 对好正、负极，盖上盖子。 7. 设置等电聚焦程序。 等电聚焦的操作 1. 取出IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室 温平衡。 2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。 3. 去除预制IPG胶条上的保护层（图2） 。 4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图 3） 。 5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油。 6. 对好正、负极，盖上盖子。 7. 设置等电聚焦程序。 等电聚焦的操作 1. 取出IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室 温平衡。 2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。 3. 去除预制IPG胶条上的保护层（图2）

10、 。 4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图 3） 。 5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油。 6. 对好正、负极，盖上盖子。 7. 设置等电聚焦程序。 胶条的平衡 冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 配制胶条平衡缓冲液 I 。 吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。 第二次平衡 ，振荡15分钟。 吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面 上。 琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1电泳 缓冲液。 胶条的转移 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 将放有胶条的SDS-PAG

11、E凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。 胶条的转移 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。 胶条的转移

12、 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。 胶条的转移 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 用镊子、压舌板或

13、是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。 胶条的转移 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。 SDS-PAGE电泳 1. 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将 凝胶转移至电泳槽中。 2. 在电泳槽

14、加入电泳缓冲液后，接通电源， 起始时用的低电流（5mA/gel/7cm），待样 品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后， 再加大电流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚 蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 3. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出 凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污 染胶面）。 双向电泳技术的应用 双向电泳技术在病原微生物致病机理研究中的应用 双向电泳技术在人类恶性肿瘤研究中的进展 人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞 与肿瘤之间的差异蛋白质组分，在寻找肿 瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以 及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供 理论依据等方面都取得了一些重要的进展

15、。 肿瘤发生的早期常常无任何症状，而只有 在转移时才容易被发现，这往往导致延误 了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期的 标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重 要。 双向电泳技术在药物作用机制研究的进展 双向电泳技术的出现，为动态、高通量的 研究药物作用机制提供了强有力的方法支 持。 双向电泳技术的另一应用就是研究药物的 毒理作用。比较正常细胞与药物处理后细 胞的蛋白质表达丰度变化，可以提示药物 的毒性作用机制。细胞在施药之后的代谢 反应做出实时的检测，不仅能确定疗效， 也能针对毒性代谢物质的发现而对药物进 行直接的改良，是一项意义深远的发现。 Western blot原理方法及应用 定义 印迹法

16、（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常 用的一种实验方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片 段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析， 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。 什么是蛋白质印迹法蛋白质印迹法 ？ Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化 技术及分子亲

17、和技术三者融为一体的综合 性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带 并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、 酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合 了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感 性和特异性，是一种能用于分析样本组分 的免疫学测定的方法。 Western Blot基本原理基本原理 Western BlotWestern Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被 检测物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价 键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类 型及其生物学活性不变。以固相载

18、体上的蛋白质 或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物 显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的 基因表达的蛋白成分。 蛋白样品制备的注意事项：蛋白样品制备的注意事项： 煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多 聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有的也可以在700C 加热5-10min，尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下 容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率。） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链

19、.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和SDS结 合后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白 的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 凝胶成份凝胶成份 M纯净水（ddH2O） M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 （Arc-Bis） MSDS MTris-HCL M四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙 烯酰胺和双丙烯酰胺的

20、聚合） M过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自 由基） 聚偏二聚偏二 氟乙烯膜氟乙烯膜 膜的选择 转膜 半干法半干法（用恒流） 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转1030min。 湿法湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转1h或过夜。 泡膜：泡膜： 转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移bufferbuffer浸泡浸泡20min20min （1.1.凝胶凝胶若是没在预冷的转膜若是没在预冷的转膜bufferbuffer中浸泡，就会在转膜过程中出现中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱凝胶皱

21、缩缩，导致出现，导致出现转移条带变形转移条带变形。2.PVDF2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）膜具有疏水性，需用甲醇浸泡） 转膜顺序：转膜顺序： 阴极碳板阴极碳板( (黑黑)+)+海绵海绵+ +三滤三滤+ +胶胶+ +膜膜+ +三滤三滤+ +海绵海绵+ +阳极碳板（白）阳极碳板（白） 转膜条件：转膜条件： 0.4A 250V 1h-90min 0.4A 250V 1h-90min 冰浴冰浴中进行转膜中进行转膜 （具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要 的转膜时间越长，反之则短。）的转膜时间越长，

22、反之则短。） 避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为 手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使 膜脏掉。 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之 间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全 。 剪膜 Western Blotting Western Blotting 操作流程操作流程 一抗、二抗孵育 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料盒中，根据滤膜面积以 0.1ml/cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育（抗体浓度过高会导致 背景较深，过低会导致和抗原结合不充分，出现假阴性 ）。室温不 少于7小时，4 时过夜。（一般） 回收一抗溶液，用TBST洗膜3次，每次5min（洗涤不充分会导致 膜上非特异性条带处仍有一抗残留，会影响二抗结合的位置不准确 ）。 加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动， 室温避光1.5-2h 回收二抗，TBST洗膜3次，每次5min，纯净水洗膜5min。 短时间多次洗膜较长时间少次洗膜更有效。 Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。 Western Blotting Western Blot