第九章 种质保存

1、植物种质资源的离体保存植物种质资源的离体保存 Beans (Phaseolus spp.) n种质种质（germplasm）是指亲代通过生殖细胞或体细胞直接）是指亲代通过生殖细胞或体细胞直接 传递给子代并决定固有生物性状的遗传物质。传递给子代并决定固有生物性状的遗传物质。 n种质保存种质保存（germplasmgermplasm conservation conservation）是指利用天然）是指利用天然 或人工创造的适宜环境，借以保存种质资源，使个体或人工创造的适宜环境，借以保存种质资源，使个体 中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，并且有强的中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，并且有强的

2、生活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。生活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。 n植物种质资源保存的方式有植物种质资源保存的方式有原生境保存原生境保存（in situ c o n s e r v a t i o n ） 和） 和 非 原 生 境 保 存非 原 生 境 保 存 （ e x s i t u conservation）。）。 n原生境保存原生境保存是指在原来的生态环境中，就地进行繁殖是指在原来的生态环境中，就地进行繁殖 保存种质，如建立自然保护区或保护小区，甚至保护保存种质，如建立自然保护区或保护小区，甚至保护 点等途径来保护作物及经济林木的野生近缘植物物种；点等途径来保护作物及经

3、济林木的野生近缘植物物种； n非原生境保存非原生境保存是指种质保存于该植物原生态生长地以是指种质保存于该植物原生态生长地以 外的地方，外的地方，包括包括异地保存（种质圃或植物园保存）、异地保存（种质圃或植物园保存）、 种质库（种子）保存、离体（试管）保存等。种质库（种子）保存、离体（试管）保存等。 n种质资源离体保存种质资源离体保存（germplasm conservation in vitro） 是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体 等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理措施使之保等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理措施使

4、之保 存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。 n离体种质保存有以下优点：离体种质保存有以下优点： 所占空间少，节省人力、物力和土地；所占空间少，节省人力、物力和土地； 有利于国际间的种质交流及濒危物种（有利于国际间的种质交流及濒危物种（endangered endangered speciesspecies）抢救和快繁；）抢救和快繁； 需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖； 避免自然灾害引起的种质丢失。避免自然灾害引起的种质丢失。 n上 世 纪上 世 纪 7 07 0 年 代 以 来 ， 人 们

5、 把 冷 冻 生 物 学年 代 以 来 ， 人 们 把 冷 冻 生 物 学 （cryobiologycryobiology）和植物离体培养技术结合起来，）和植物离体培养技术结合起来， 发展了发展了离体种质资源冷冻保存离体种质资源冷冻保存（freezing freezing conservation conservation in vitroin vitro）或）或超低温保存超低温保存 （cryopreservationcryopreservation）技术。）技术。 n随着离体种质保存技术的不断发展和完善，已经随着离体种质保存技术的不断发展和完善，已经 或正在建立离体保存库。如或正在建立离体保

6、存库。如国家种质徐州甘薯试国家种质徐州甘薯试 管苗库管苗库保存甘薯保存甘薯14001400份，份，国家种质克山马铃薯试国家种质克山马铃薯试 管苗库管苗库保存马铃薯保存马铃薯900900份。份。 n离体保存方法离体保存方法：常温限制生长保存、低温保存和：常温限制生长保存、低温保存和 超低温保存。超低温保存。 一、常温限制生长保存的概念一、常温限制生长保存的概念 （一）高渗保存法（一）高渗保存法 高渗保存法高渗保存法是指通过提高培养基的渗透压，减少离体培养是指通过提高培养基的渗透压，减少离体培养 物从培养基中吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程，从而物从培养基中吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程

7、，从而 减缓生长速度，达到抑制培养物生长的保存方法。（继代培养减缓生长速度，达到抑制培养物生长的保存方法。（继代培养 间隔时间可延长到间隔时间可延长到1 1年）年） 方法：方法：1 1）提高蔗糖浓度：）提高蔗糖浓度：10%10%左右，就可达到抑制培养物生长左右，就可达到抑制培养物生长 的目的。由于蔗糖是组培中最常用的碳源和能源，提高渗透压的同的目的。由于蔗糖是组培中最常用的碳源和能源，提高渗透压的同 时又对材料生理代谢产生不利的影响。时又对材料生理代谢产生不利的影响。 2 2）添加惰性物质：）添加惰性物质：如甘露醇、山梨醇等都是优良的渗透压调节如甘露醇、山梨醇等都是优良的渗透压调节 物质，这样

8、可以使其限制离体培养物生长的作用维持更久。一般用物质，这样可以使其限制离体培养物生长的作用维持更久。一般用 4%4%6%6%甘露醇甘露醇处理培养基，或用处理培养基，或用2%2%3%3%蔗糖加蔗糖加2%2%5%5%的甘露醇的甘露醇混合混合 处理。处理。 3 3）增加培养基中琼脂的用量）增加培养基中琼脂的用量来提高渗透压，降低培养物的生长来提高渗透压，降低培养物的生长 速率。速率。 常温限制生长保存的方法有：提高渗透压、常温限制生长保存的方法有：提高渗透压、 添加生长延缓剂或抑制剂、干燥、降低气添加生长延缓剂或抑制剂、干燥、降低气 压、改变光照条件等。压、改变光照条件等。 （二）生长抑制剂保存法（

9、二）生长抑制剂保存法 在离体种质保存中使用植物生长抑制剂可以延缓或抑制离在离体种质保存中使用植物生长抑制剂可以延缓或抑制离 体培养物的生长，延长继代时间以达到离体保存种质的目的。体培养物的生长，延长继代时间以达到离体保存种质的目的。 生长抑制剂保存法生长抑制剂保存法是指在培养基中加入生长抑制剂或延缓是指在培养基中加入生长抑制剂或延缓 剂如剂如ABAABA、青鲜素、矮壮素（、青鲜素、矮壮素（CCCCCC）、）、B9B9、多效唑、烯效唑等。、多效唑、烯效唑等。 如在培养基中加入如在培养基中加入5 510mg/L ABA10mg/L ABA，使马铃薯等茄属植物的，使马铃薯等茄属植物的 外植体继代培养

10、间隔期延至外植体继代培养间隔期延至1 1年以上。李维等（年以上。李维等（19931993）利用）利用B9B9 和和CCCCCC使葡萄试管苗继代周期由使葡萄试管苗继代周期由3 3个月变为个月变为1 1年。年。多效唑多效唑可使小可使小 麦和马铃薯的继代周期延长，同时使试管苗粗壮、移栽成活率麦和马铃薯的继代周期延长，同时使试管苗粗壮、移栽成活率 提高。提高。 常温限制生长保存的方法有：提高渗透压、常温限制生长保存的方法有：提高渗透压、 添加生长延缓剂或抑制剂、干燥、降低气添加生长延缓剂或抑制剂、干燥、降低气 压、改变光照条件等。压、改变光照条件等。 （三）常温限制生长的其他保存法（三）常温限制生长的

11、其他保存法 1 1低压保存法低压保存法 通过降低培养容器内氧分压或改变培养环境的气体状况，通过降低培养容器内氧分压或改变培养环境的气体状况， 能抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到离能抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到离 体保存种质的目的。体保存种质的目的。 低压保存方法：低压保存方法：降低气压降低气压和和降低氧分压降低氧分压。 降低气压降低气压是通过降低培养物周围的大气压而起作用，其是通过降低培养物周围的大气压而起作用，其 结果是降低了所有气体分压，使培养物的生长速度降低。结果是降低了所有气体分压，使培养物的生长速度降低。 降低氧分压降低氧分压是在正常气压下，向培养

12、容器中加进氮气等是在正常气压下，向培养容器中加进氮气等 惰性气体，使其中氧分压降低到较低水平，从而达到抑制生惰性气体，使其中氧分压降低到较低水平，从而达到抑制生 长的目的。长的目的。 2020世纪世纪8080年代，年代，BridginBridgin等在烟草离体茎尖和愈伤组织保等在烟草离体茎尖和愈伤组织保 存时采用了此方法，把培养容器内可利用的氧气降低到存时采用了此方法，把培养容器内可利用的氧气降低到60%60%， 6 6周内培养物生长量减少了周内培养物生长量减少了60%60%80%80%。 （三）常温限制生长的其他保存法（三）常温限制生长的其他保存法 2 2饥饿法饥饿法 即从培养基中减去某种或

13、几种营养元素，或者降低某些即从培养基中减去某种或几种营养元素，或者降低某些 营养物质的浓度，或者略微改变培养基成分，使培养植株处营养物质的浓度，或者略微改变培养基成分，使培养植株处 于最小生长阶段。于最小生长阶段。 通过调整培养基的养分水平（通过调整培养基的养分水平（l/2MSl/2MS、l/4MSl/4MS），可有效），可有效 地限制细胞生长。如菠萝组培苗在地限制细胞生长。如菠萝组培苗在l/4MSl/4MS培养基上保存培养基上保存1 1年，年， 小苗存活率达到小苗存活率达到100%100%。 一、低温保存的概念一、低温保存的概念 植物种质资源的低温保存植物种质资源的低温保存(low temp

14、erature conservation)(low temperature conservation) 是指用离体培养的方式在非冻结程度的低温下（一般为是指用离体培养的方式在非冻结程度的低温下（一般为1 199） 保存种质的方法。低温保存种质资源具有保存种质的方法。低温保存种质资源具有方法简单、存活率高方法简单、存活率高 的特点。的特点。 二、低温保存的原理二、低温保存的原理 在植物的生长条件中，在植物的生长条件中，温度温度是一个重要的因素。植物要生长是一个重要的因素。植物要生长 必需有适宜的温度，温度降低以后，植物的生长速度就会受到必需有适宜的温度，温度降低以后，植物的生长速度就会受到 抑制

15、而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔而达抑制而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔而达 到保存种质的目的。到保存种质的目的。 三、低温保存的方法 植物对低温的耐受力不仅取决于基因型，也与它们的起植物对低温的耐受力不仅取决于基因型，也与它们的起 源和生长的生态条件有关。源和生长的生态条件有关。在低温保存植物培养物过程中，在低温保存植物培养物过程中， 正确选择适宜低温是保存后高存活率的关键。正确选择适宜低温是保存后高存活率的关键。 温带植物保存的最适低温在温带植物保存的最适低温在0 066，如马铃薯、苹果、，如马铃薯、苹果、 草莓及大多数草本植物。草莓及大多数草本植物。 热带植物

16、保存的最适低温为热带植物保存的最适低温为15152020。如木薯、甘薯。如木薯、甘薯。 葡萄植株在葡萄植株在99条件下，每年转换一次新鲜培养基，可条件下，每年转换一次新鲜培养基，可 以保存以保存1515年之久，而常温条件下需要年之久，而常温条件下需要1 13 3个月转接一次。个月转接一次。 Galay(1969)Galay(1969)在在2m2m2 2实验室面积上保存实验室面积上保存800800个葡萄品种，个葡萄品种， 而在田间需而在田间需1 1公顷土地。草莓在低温下保存公顷土地。草莓在低温下保存7272个月，存活率个月，存活率 达达100%100%。 一、种质资源超低温保存概述一、种质资源超

17、低温保存概述 植物超低温种质保存植物超低温种质保存是指将植物的离体材料经过一定的方法是指将植物的离体材料经过一定的方法 处理后在超低温（一般是指液氮温度，处理后在超低温（一般是指液氮温度，196196）条件下）条件下 进行保存的方法。进行保存的方法。 超低温下保存材料的细胞超低温下保存材料的细胞物质代谢和生长活动几乎完全停止物质代谢和生长活动几乎完全停止， 这不仅能够保持生物材料的这不仅能够保持生物材料的遗传稳定性遗传稳定性，也不会丧失其形，也不会丧失其形 态发生的潜能（态发生的潜能（保持其再生能力保持其再生能力），已成为长期稳定地保），已成为长期稳定地保 存植物种质资源及珍贵实验材料的一个重

18、要方法。存植物种质资源及珍贵实验材料的一个重要方法。 迄今为止，已对迄今为止，已对100100多种植物材料多种植物材料进行了超低温保存，进行了超低温保存， 涉及涉及保存的材料保存的材料有原生质体、悬浮细胞、愈伤组有原生质体、悬浮细胞、愈伤组 织、体细胞胚、胚、花粉、茎尖（根尖）分生组织、体细胞胚、胚、花粉、茎尖（根尖）分生组 织、芽、茎段和种子等。织、芽、茎段和种子等。 植物离体材料的超低温保存是长期保存种质资源的植物离体材料的超低温保存是长期保存种质资源的 理想方法。理想方法。组织培养物的超低温保存可以节组织培养物的超低温保存可以节 约大量的人力、物力和土地，克服长期继代培养约大量的人力、物

19、力和土地，克服长期继代培养 导致的再生能力丧失，也便于国际间种质资源的导致的再生能力丧失，也便于国际间种质资源的 交流。交流。 二、种质资源超低温保存的原理二、种质资源超低温保存的原理 在液氮中植物细胞与组织的代谢活动停止、不发在液氮中植物细胞与组织的代谢活动停止、不发 生遗传变异；当解冻后，细胞重新恢复生长能力。生遗传变异；当解冻后，细胞重新恢复生长能力。 基本程序包括：基本程序包括：植物材料（培养物）的选取植物材料（培养物）的选取、材料、材料 的预处理、的预处理、冷冻处理冷冻处理、冷冻贮存、冷冻贮存、解冻处理解冻处理、 细胞活力和变异评价、细胞活力和变异评价、再培养再培养等。其中最重要等。

20、其中最重要 的环节是的环节是冷冻和解冻冷冻和解冻处理。处理。 （一）超低温保存材料的选取 p在超低温离体保存种质中，已经研究或应用过的植物材料在超低温离体保存种质中，已经研究或应用过的植物材料 或培养物主要有三类：或培养物主要有三类：愈伤组织、悬浮细胞、原生质体；愈伤组织、悬浮细胞、原生质体； 花粉和花粉胚；花粉和花粉胚；茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植物。茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植物。 p超低温保存离体种质的实际应用中，需考虑培养物的超低温保存离体种质的实际应用中，需考虑培养物的再生再生 能力、变异性和抗冻性能力、变异性和抗冻性。选择遗传稳定性好、容易再生和抗选择遗传稳定性好、容易再生和抗 冻性强

21、的离体培养物作为保存材料冻性强的离体培养物作为保存材料是超低温保存离体种质成是超低温保存离体种质成 功的关键。功的关键。 p茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株等有组织结构的离体材料，等有组织结构的离体材料， 是是理想的离体保存材料理想的离体保存材料因为因为其遗传稳定性好，易于再生，其遗传稳定性好，易于再生， 且细胞体积小，液泡小，原生质稠密、含水量较低，细胞质且细胞体积小，液泡小，原生质稠密、含水量较低，细胞质 较浓，比含有大液泡的愈伤组织细胞更抗冻。较浓，比含有大液泡的愈伤组织细胞更抗冻。 目的：目的：使材料适应将要遇到的低温，提高自由水含量低的使材料适应将要遇到的低温

22、，提高自由水含量低的 新细胞的生成，避免冷冻过程中细胞内大的冰晶的形成，提新细胞的生成，避免冷冻过程中细胞内大的冰晶的形成，提 高细胞的成活率和再生能力。高细胞的成活率和再生能力。 方法：方法：对超低温保存的离体培养物进行加速继代、提高培对超低温保存的离体培养物进行加速继代、提高培 养基渗透压、加入冷冻防护剂和低温预处理。养基渗透压、加入冷冻防护剂和低温预处理。 预处理时间：预处理时间：一般为一般为3 34 4周。周。 1 1加速继代加速继代 加速继代培养以提高新分裂细胞的比例。因为新分裂的加速继代培养以提高新分裂细胞的比例。因为新分裂的 细胞小，胞内自由水含量少，在冷冻过程中细胞内不易形成细

23、胞小，胞内自由水含量少，在冷冻过程中细胞内不易形成 大冰晶，细胞不易受害。大冰晶，细胞不易受害。 2 2提高培养基渗透压提高培养基渗透压 用甘露醇、山梨醇和蔗糖等提高培养基渗透压，以提高培用甘露醇、山梨醇和蔗糖等提高培养基渗透压，以提高培 养组织和细胞的渗透压来提高抗寒力。如在含养组织和细胞的渗透压来提高抗寒力。如在含8%8%蔗糖的改良蔗糖的改良 MSMS液体培养基振荡预培养液体培养基振荡预培养6d6d，红豆杉愈伤组织在超低温保存，红豆杉愈伤组织在超低温保存 后细胞活力可保持最高。后细胞活力可保持最高。 3 3添加冷冻防护剂添加冷冻防护剂 冷冻防护剂在溶液中能够产生强烈的水合作用，提高溶冷冻防

24、护剂在溶液中能够产生强烈的水合作用，提高溶 液的黏滞性，进而保护细胞免遭冻害。用冷冻防护剂对材料液的黏滞性，进而保护细胞免遭冻害。用冷冻防护剂对材料 进行预处理可明显提高细胞的存活率和再生能力。进行预处理可明显提高细胞的存活率和再生能力。 常用的冷冻防护剂：常用的冷冻防护剂： 糖类、糖类、PEGPEG、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。 DMSODMSO是最好的防护剂。是最好的防护剂。 有时常把几种冷冻防护剂混合使用，降低冷冻防护剂的有时常把几种冷冻防护剂混合使用，降低冷冻防护剂的 毒性，提高细胞存活率和再生能力。毒性，提高细胞存活率和再生能力。 4 4低温预处理低温预

25、处理 低温预处理是将离体培养物置于一定的低温环境中（低温预处理是将离体培养物置于一定的低温环境中（0 0 44），使其接受低温锻炼，），使其接受低温锻炼，细胞内可溶性糖及其类似的细胞内可溶性糖及其类似的 具有低温保护功能的物质积累，束缚水具有低温保护功能的物质积累，束缚水/ /自由水比值增大，自由水比值增大， 原生质的黏度、弹性增大，代谢活动减弱，提高其抗寒能原生质的黏度、弹性增大，代谢活动减弱，提高其抗寒能 力。力。 如苹果离体根尖的超低温保存，要保存的离体根尖应先在如苹果离体根尖的超低温保存，要保存的离体根尖应先在 44下锻炼下锻炼4 45 5周。有的植物可以逐渐降温培养，使超低周。有的植

26、物可以逐渐降温培养，使超低 温保存成活率大大提高。旺盛分裂的细胞和经过冬季锻炼温保存成活率大大提高。旺盛分裂的细胞和经过冬季锻炼 的植物组织都具有较强的抗寒能力，如早期胚胎和冬眠芽。的植物组织都具有较强的抗寒能力，如早期胚胎和冬眠芽。 1 1传统的降温冷冻方法传统的降温冷冻方法 传统的超低温冷冻保存方法是通过传统的超低温冷冻保存方法是通过预培养、冷预培养、冷 冻保护剂处理、降温速度和转移温度冻保护剂处理、降温速度和转移温度等关键环节，等关键环节， 创造合适的保护性脱水程度，实现超低温保存种质创造合适的保护性脱水程度，实现超低温保存种质 资源。资源。 从降温方式来看，超低温冷冻保存方法有从降温方

27、式来看，超低温冷冻保存方法有快速快速 冷冻法、慢速冷冻法、两步冷冻法和逐级冷冻法冷冻法、慢速冷冻法、两步冷冻法和逐级冷冻法等等 几种。几种。 1 1传统的降温冷冻方法传统的降温冷冻方法 （1 1）快速冷冻法：）快速冷冻法：将保存材料从将保存材料从0或其它预培养温度或其它预培养温度 直接投入液氮中保存。其降温速度在直接投入液氮中保存。其降温速度在1000/min以上。以上。 适于材料：适于材料：高度脱水的植物材料（如种子、花粉、球茎或块高度脱水的植物材料（如种子、花粉、球茎或块 根等）、经过冬季的低温锻炼抗寒性较强的木本植物的枝根等）、经过冬季的低温锻炼抗寒性较强的木本植物的枝 条和芽。条和芽。

28、 原理：原理：细胞内的水分在降温冷冻过程中，细胞内的水分在降温冷冻过程中，14010是是 冰晶形成和增长的危险温度区，在冰晶形成和增长的危险温度区，在140以下，冰晶不以下，冰晶不 再增长，快速冷冻法就是利用了在液氮中温度骤然降低到再增长，快速冷冻法就是利用了在液氮中温度骤然降低到 最低点（最低点（196），使细胞内水分迅速通过冰晶生成的），使细胞内水分迅速通过冰晶生成的 危险温度区，产生的玻璃化状态对细胞结构不产生破坏作危险温度区，产生的玻璃化状态对细胞结构不产生破坏作 用，从而减轻或避免细胞内结冰所造成的危害。用，从而减轻或避免细胞内结冰所造成的危害。 1 1传统的降温冷冻方法传统的降温冷

29、冻方法 （2 2）慢速冷冻法：）慢速冷冻法：在冷冻保护剂存在下，以在冷冻保护剂存在下，以0.1 10/min降温速度从降温速度从0降到降到70，接着浸入液氮中进，接着浸入液氮中进 行冷冻保存。行冷冻保存。 这样可以使细胞内的水分有充足的时间流到细胞外结冰，从这样可以使细胞内的水分有充足的时间流到细胞外结冰，从 而使细胞内的水分减少到最低限度，避免细胞内形成冰晶；而使细胞内的水分减少到最低限度，避免细胞内形成冰晶； 同时同时又能防止因溶质含量增加引起的又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应溶液效应”的毒害。的毒害。 适合材料：适合材料：大多数植物离体种质的保存，即使是体积较大、大多数植物离体种质

30、的保存，即使是体积较大、 液泡大、含水量较高的植物材料，也可以用此法保存得到液泡大、含水量较高的植物材料，也可以用此法保存得到 较好的保存效果。慢速冷冻法需要配备程序降温器，技术较好的保存效果。慢速冷冻法需要配备程序降温器，技术 系统昂贵。系统昂贵。 1 1传统的降温冷冻方法传统的降温冷冻方法 （3 3）两步冷冻法：）两步冷冻法：慢速冷冻和快速冷冻结合起来的一种冰冻方法。慢速冷冻和快速冷冻结合起来的一种冰冻方法。 在冷冻保护剂存在下，先用慢速冷冻法（降温速度在冷冻保护剂存在下，先用慢速冷冻法（降温速度0.1 4/min）降到转移温度（一般为）降到转移温度（一般为7040），在此温），在此温 度

31、下平衡度下平衡0.52 h，使细胞达到保护性脱水状态；然后投入液，使细胞达到保护性脱水状态；然后投入液 氮中迅速冷冻。目前，大多采用氮中迅速冷冻。目前，大多采用0.54/min的降温速度降到的降温速度降到 40，然后投入液氮保存。，然后投入液氮保存。Brison等（等（1995）用两步法保存）用两步法保存 两个桃砧木品种离体培养的茎尖，再生率达到两个桃砧木品种离体培养的茎尖，再生率达到69%和和74%。 （4 4）逐级冷冻法：）逐级冷冻法：材料经保护剂在材料经保护剂在0预处理后，依次经过预处理后，依次经过 10、15、23、40、70等温度处理，在每级等温度处理，在每级 温度上停留一定时间（约

32、温度上停留一定时间（约5min），然后浸入液氮。），然后浸入液氮。 甘蔗愈伤组织在甘蔗愈伤组织在0的冷冻防护剂（的冷冻防护剂（10%DMSO0.5mol/L 山梨醇）中预处理山梨醇）中预处理3040min，接着以，接着以1/min的降温速度从的降温速度从 0降到降到40，停留，停留13h，投入液氮中保存，半年后仍可再，投入液氮中保存，半年后仍可再 生大量植株。生大量植株。 2玻璃化保存法 液体固化方式：液体固化方式：形成尖锐的冰晶；形成尖锐的冰晶；进入无定形的非晶体（玻进入无定形的非晶体（玻 璃化）状态。璃化）状态。 玻璃化玻璃化（vitrificationvitrification）是指液体

33、转变为非晶体（玻璃态）的）是指液体转变为非晶体（玻璃态）的 固化过程。固化过程。 玻璃化法超低温保存种质资源玻璃化法超低温保存种质资源就是将生物材料经高浓度玻璃化就是将生物材料经高浓度玻璃化 保护剂处理使其快速脱水后直接投入液氮，使生物材料和玻璃化保保护剂处理使其快速脱水后直接投入液氮，使生物材料和玻璃化保 护剂发生玻璃化转变，进入玻璃化状态。此间水分子没有发生重排，护剂发生玻璃化转变，进入玻璃化状态。此间水分子没有发生重排， 不形成冰晶，也不产生结构和体积的变化，因而不会由于细胞内结不形成冰晶，也不产生结构和体积的变化，因而不会由于细胞内结 冰造成机械损伤或溶液效应而伤害组织和细胞，保证快速

34、化冻后细冰造成机械损伤或溶液效应而伤害组织和细胞，保证快速化冻后细 胞仍有活力。胞仍有活力。 特点：特点：与传统的超低温保存方法相比，玻璃化法操作简单、重与传统的超低温保存方法相比，玻璃化法操作简单、重 演性好，避免了一些种质的冷敏感问题，并且在复杂的组织和器官演性好，避免了一些种质的冷敏感问题，并且在复杂的组织和器官 的超低温保存方面有较好的应用潜力，因而是一种较理想的超低温的超低温保存方面有较好的应用潜力，因而是一种较理想的超低温 保存方法。但由于保存方法。但由于PVSPVS（plant vitrificationplant vitrification solution solution）

35、保护剂）保护剂 浓度很高，对材料毒害性极大，因此需严格控制脱水过程及冰冻保浓度很高，对材料毒害性极大，因此需严格控制脱水过程及冰冻保 护剂的渗透性。护剂的渗透性。 3包埋脱水法超低温保存 包埋脱水法包埋脱水法（encapsulation-dehydration method）是将包）是将包 含有样品的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶液，因褐藻酸钙的生成含有样品的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶液，因褐藻酸钙的生成 而固化成球状颗粒，然后将包埋后含有保存材料的藻酸钙小而固化成球状颗粒，然后将包埋后含有保存材料的藻酸钙小 珠在含有高浓度蔗糖的培养基上预培养，使样品获得高的抗珠在含有高浓度蔗糖的培养基上预培养，使样品获

36、得高的抗 冻力和抗脱水力后，结合适当的脱水和降温方式，最后浸入冻力和抗脱水力后，结合适当的脱水和降温方式，最后浸入 液氮中保存。液氮中保存。 特点：特点：与玻璃化法相比，包埋脱水法采用高浓度的蔗糖预与玻璃化法相比，包埋脱水法采用高浓度的蔗糖预 处理样品，对低温保护剂敏感的植物样品有着很大的应用潜处理样品，对低温保护剂敏感的植物样品有着很大的应用潜 力。包埋脱水法也不需要昂贵、复杂的降温设备，降温过程力。包埋脱水法也不需要昂贵、复杂的降温设备，降温过程 不甚严格；同时避免了玻璃化中二甲基亚砜等高浓度保护剂不甚严格；同时避免了玻璃化中二甲基亚砜等高浓度保护剂 对材料可能造成的损害；样品易于操作，被

37、保存样品体积可对材料可能造成的损害；样品易于操作，被保存样品体积可 以比较大；样品可获得较高的抗冻力，使保存后的样品不经以比较大；样品可获得较高的抗冻力，使保存后的样品不经 愈伤组织直接成苗，降低了遗传变异的可能。愈伤组织直接成苗，降低了遗传变异的可能。 4包埋玻璃化法超低温保存 包埋玻璃化法包埋玻璃化法(encapsulation-vitrification method)是包埋脱是包埋脱 水法与玻璃化法的结合，克服了玻璃化法和包埋脱水法的水法与玻璃化法的结合，克服了玻璃化法和包埋脱水法的 缺点。缺点。 基本操作程序：基本操作程序：预培养和包埋预培养和包埋玻璃化溶液脱水玻璃化溶液脱水液氮保液

38、氮保 存存化冻化冻恢复培养。恢复培养。 5其它保存方法 （1）干燥法：）干燥法：干燥法是利用无菌空气流、真空、干燥硅干燥法是利用无菌空气流、真空、干燥硅 胶饱和溶液表面的气相等对样品进行脱水，然后快速将样胶饱和溶液表面的气相等对样品进行脱水，然后快速将样 品投入液氮冻存。品投入液氮冻存。 （2）预培养法：预培养法是将保存材料在含有冷冻保护）预培养法：预培养法是将保存材料在含有冷冻保护 剂的培养基上预培养一段时间，以诱导脱水，然后将脱水剂的培养基上预培养一段时间，以诱导脱水，然后将脱水 材料浸入液氮进行保存。该方法主要用于合子胚和顶端分材料浸入液氮进行保存。该方法主要用于合子胚和顶端分 生组织的

39、保存。生组织的保存。 （3）预培养干燥法：）预培养干燥法：此方法是预培养法和干燥法结合此方法是预培养法和干燥法结合 的冷冻保存方法。材料先在含冷冻保护剂的培养基上预培的冷冻保存方法。材料先在含冷冻保护剂的培养基上预培 养，并进行干燥，然后浸入液氮保存。有些研究者用高浓养，并进行干燥，然后浸入液氮保存。有些研究者用高浓 度盐溶液和压缩空气流处理，使要保存的材料脱水干燥。度盐溶液和压缩空气流处理，使要保存的材料脱水干燥。 （四）解冻（四）解冻 解冻解冻是将液氮中保存的材料取出，使其融化，以便进一是将液氮中保存的材料取出，使其融化，以便进一 步恢复培养。步恢复培养。解冻的速度解冻的速度是解冻技术的关

40、键，可分为是解冻技术的关键，可分为快速解快速解 冻和慢速解冻冻和慢速解冻两种方法。超低温冷冻材料解冻时，再次结冰两种方法。超低温冷冻材料解冻时，再次结冰 的危险区域是的危险区域是6050。从理论上讲，可借助迅速的解。从理论上讲，可借助迅速的解 冻速度通过此温度区，从而避免细胞内次生结冰。冻速度通过此温度区，从而避免细胞内次生结冰。 1快速解冻法：快速解冻法：快速解冻法是把冷冻的材料取出后，快速解冻法是把冷冻的材料取出后， 迅速放入迅速放入3540（该温度下解冻速度一般为（该温度下解冻速度一般为500 700/min）温水浴中解冻，并小心摇动，待材料中的冰晶）温水浴中解冻，并小心摇动，待材料中的

41、冰晶 完全融化为止。完全融化为止。 由于此法融冰的速度快，细胞内的水分来不及再次形成由于此法融冰的速度快，细胞内的水分来不及再次形成 冰晶就已完全融化，因而对细胞的损伤较轻。冰晶就已完全融化，因而对细胞的损伤较轻。 2慢速解冻法慢速解冻法：把材料置于把材料置于0或或23的低温下慢慢融的低温下慢慢融 化。少数超低温保存的材料只有采用慢速解冻才能存活，化。少数超低温保存的材料只有采用慢速解冻才能存活， 如木本植物的冬眠芽，因其在慢速冷冻的过程中，经受了如木本植物的冬眠芽，因其在慢速冷冻的过程中，经受了 一个低温锻炼过程，细胞内的水分已最大限度地渗透到细一个低温锻炼过程，细胞内的水分已最大限度地渗透到细 胞外，若解冻速度太快，细胞吸水过猛，细胞膜就会受到胞外，若解冻速度太快，细胞吸水过猛，细胞膜就会受到 强烈的渗透冲击而破裂，进而导致材料死亡。强烈的渗透冲击而破裂，进而导致材料死亡。 （