RT-PCR原理和试验步骤

1、实用文档RT-PCR原理与实验步骤一、知识背景：1、基因表达： DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104 个丝心蛋白 mRN(A 每个 mRNA存活 4d，可以合成 105 个丝心蛋白)共合成 109 个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的 mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常 重要的。2、PCR技术 (Polymerase chain reaction) ：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A. 变性：通过加热使 DNA双螺旋的氢键断裂，形成

2、单链 DNA；B. 退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C. 延伸：在 DNA聚合酶和 dNTPs及 Mg2存在下，退火引物沿 53 方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶( reverse transcriptase )是存在于 RNA病毒体内的依赖 RNA的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖 RNA的 DNA聚合酶活性：以 RNA为模板合成 cDNA第一条链；2、Rnase 水解活性：水解 RNA:DNA杂合体中的 RNA；3、依赖 DNA的 DNA聚合酶活性：以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA.二、RT-

3、PCR的准备：1. 引物的设计及其原则：1) 引物的特异性决定 PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至 关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚 型，不同的 mRNA剪切方式以及可能存在的 hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆 盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存 在的内含子。2) 引物设计原则的把握引物设计原则包括 :a、引物长度 : 一般为 1530bp ，引物太短会影响 PCR的特异性，引物太长 PCR的最 适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好

4、应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现 3 个以上的单一碱基。 GC含量( Tm值)： 40 60， PCR扩增的复性温度一般是 较低 Tm值减去 5 10 度。c 、 3 端要求： 3 端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任 何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低， G、C 居中间，因此引物的 3端最好选用 A、 G、 C而尽可能避免连续出现两个以上的 T。d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或 引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4 个连续碱基互补， 3端不应超过 2个。f 、同源序列

5、：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。实用文档g、5端无严格限制： 5末端碱基可以游离，但最好是 G或 C，使 PCR产物的末端结 合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0 ， Oligo6.0 等对 于这些条件都可以自行设置。2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过 0.1%DEPC水浸泡处理，除去 RNA酶，防止操作过程中 RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活 DEPC）。3、试剂准备： 变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经 DEPC处

6、理并高压的水。三、RNA的提取方法RT PCR中从细胞分离的 RNA的质量至关重要，包括 RNA的纯度和完整性。 RNA分 离的最关键因素是尽量减少 RNA酶的污染。但 RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细 胞内源性 RNA酶外，环境中也存在大量 RNA酶。因此在提取 RNA时，应尽量创造一个 无 RNA酶的环境，包括去除外源性 RNA酶污染和抑制内源性 RNA酶活性，主要是采用 焦碳酸二乙酯（ DEPC）去除外源性 RNA酶，通过 RNA酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋 白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性 RNA酶。实用文档实用文档实用文档实用文档RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤来源

7、：生物谷 访问量： 3688评论（0）分享 1一、实验目的掌握植物总 RNA非变性胶电泳的原理和方法。二、实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4% 的凝胶，不同的 RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条 件下， RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总 RNA样品完整性时，配制普通的 1%琼脂糖凝胶即可。三、实验材料、器具及药品蘑菇的总 RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫 外透射检测仪等。 琼脂糖， 1XTAE电泳缓冲液， 0.5 g/m

8、l 溴化乙锭（ EB）10X 载样缓冲液。四、实验步骤（ 1）用 1TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加 1TAE电泳缓冲液至液面覆盖 凝胶。（ 2）在超净工作台上，用移液器吸取总 RNA样品 4 l 于封口膜上。在实验台 上再加入 5l 1 TAE电泳缓冲液及 1 l 的 10X载样缓冲液，混匀后，小心 加入点样孔。实用文档（ 3）打开电源开关，调节电压至 100V，使 RNA由负极向正极电泳，约 30min 后将凝胶放入 EB染液中染色 5min, 用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察 RNA电泳结果。RNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂：（ 1） MOPS缓冲液（ 10* ）:0.4mol/L

9、 吗啉代丙烷磺酸（ MOP）S （Ph7.0） ， 0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA 。（2）上样染料： 50%甘油， 1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝， 0.4%二甲苯蓝。（3）甲醛。实用文档（ 4）去离子甲酰胺。 v 电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲 洗乙醇干燥 3%H2O灌2 满室温放置 10分钟 0.1%DEPC水冲洗。 操作：（ 1） 将制胶用具用 70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。（ 2） 配制琼脂糖凝胶。 称取 0.5g 琼脂糖，置干净的 100ml 锥形瓶中，加入 40ml 蒸馏水，微波炉内 加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 待胶凉至 60-70 ，依次向其中加入 9ml 甲醛、 5ml 10X MOPS缓冲液和 0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。 灌制琼脂糖凝胶。（ 3） 样品准备： 取 DEPC处理过的 500ul 小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS 缓冲液 2ul ，甲醛 3.5ul,